Αυτό το λήμμα αφορά την πρωτεΐνη ως χημική ουσία. Γιατην πρωτεΐνη ως τρόφιμο ή θρεπτική ουσία , δείτε: Πρωτεΐνη (τρόφιμο).
Το λήμμα δεν περιέχει πηγές ή αυτές που περιέχει δεν επαρκούν.Μπορείτε να βοηθήσετε προσθέτοντας την κατάλληλη τεκμηρίωση. Υλικό που είναι ατεκμηρίωτο μπορεί να αμφισβητηθεί καινα αφαιρεθεί. Η σήμανση τοποθετήθηκε στις 09/12/2011.
Οιπρωτεΐνες αποτελούν ταπιο διαδεδομένα και πολυδιάστατα, τόσο στη μορφή όσο καιστη λειτουργία τους, μακρομόρια.
Αναπαράσταση της τριδιάστατης δομής της μυοσφαιρίνης, που παρουσιάζεται με χρωματισμένες τις άλφα έλικες. Αυτή ήταν η πρώτη πρωτεΐνη, η δομή της οποίας προσδιορίστηκε μεκρυσταλλογραφία ακτίνων X.
Ακόμη καισε ένα φαινομενικά «απλό» κύτταρο ενός βακτηρίου εντοπίζονται εκατοντάδες διαφορετικές πρωτεΐνες, μετην καθεμία εξ αυτών να έχει ιδιαίτερο ρόλο. Οι πρωτεΐνες αποτελούν είτε δομικά συστατικά των μεμβρανών του κυττάρου, είτε συνεργούν σε κάποια συγκεκριμένη λειτουργία, όπως η δημιουργία πρωτεϊνικών συμπλόκων. Είναι μεγάλα σύνθετα βιομόρια, μεμοριακό βάρος από 10.000 μέχρι πάνω από 1 εκατομμύριο, αποτελούμενα από αμινοξέα, τα οποία ενώνονται μεταξύ τους μεπεπτιδικούς δεσμούς σχηματίζοντας μια γραμμική αλυσίδα, καλούμενη αλυσίδα πολυπεπτιδίων.
Όλες οι πρωτεΐνες περιέχουν άνθρακα, οξυγόνοκαιάζωτοκαιοι περισσότερες εξ αυτών καιθείοκαι υδρογόνο, αφού τα αμινοξέα περιέχονται από αυτό.
Ηακολουθία αμινοξέωνσεμια πρωτεΐνη καθορίζεται από ένα γονίδιοκαι κωδικοποιείται κατά τονγενετικό κώδικα DNA. Παρόλο πουο γενετικός κώδικας κωδικοποιεί 20 αμινοξέα, τα αμινοξέα που συνιστούν την πρωτεΐνη συχνά υφίστανται χημικές αλλαγές κατά τημετα-μεταγραφική τροποποίηση: προτού η πρωτεΐνη να μπορέσει να λειτουργήσει είτε στοκύτταρο, είτε ως τμήμα των μηχανισμών ελέγχου.[1]
Οι πρωτεΐνες παράγονται από ταριβοσώματαπου βρίσκονται μέσα στοκυτταρόπλασμακαι αρχικά εμφανίζονται ως απλές μη διακλαδωμένες αλληλουχίες αμινοξέων, δηλαδή πεπτιδίων ή πολυπεπτιδίων, σχηματίζοντας την "πρωτοταγή δομή", γιατην οποία καθοριστικοί παράγοντες είναι τανουκλεϊκά οξέα, τα οποία και φέρονται να ελέγχουν όλες τις λειτουργίες αλλά καιτα κληρονομικά γνωρίσματα των οργανισμών.
Στη συνέχεια όλα τα πολυπεπτίδια υφίστανται μια φυσική διαμόρφωση προκειμένου να αποκτήσουν μια "δευτεροταγή δομή" η οποία προκαλείται από δεσμούς υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των καρβοξυλομάδων καιτων αμινομάδων των αμινοξέων. Ο πλέον διαδεδομένος τύπος τέτοιας μορφής πολυπεπτιδίου είναι η λεγόμενη "α-έλικα", δεξιόστροφη, όπου οι σπείρες διατηρούνται στη θέση τους με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των καρβοξυλομάδων καιτων αμινομάδων των αμινοξέων. Μια άλλη δευτεροταγής δομή είναι η λεγόμενη "β-πτυχωτή επιφάνεια" όπου στη περίπτωση αυτή διασταυρώνονται παράλληλες αλυσίδες πολυπεπτιδίων που ενώνονται στις διασταυρώσεις με δεσμούς υδρογόνου σχηματίζοντας έτσι μια εξαιρετικά σφιχτή δομή, όπως στομετάξι. Οι πρωτεΐνες με τέτοιες σχετικά απλές δισδιάστατες δευτερογενείς δομές ονομάζονται γενικά ινώδεις πρωτεΐνες.
Στη συνέχεια τα πολυπεπτίδια υφίστανται ακόμα πιο περίπλοκο δίπλωμα (πτύχωση) το οποίο καλείται "τριτοταγής δομή". Μετον όρο τριτοταγή δομή, εννοούμε το τελικό και λειτουργικό σχήμα που αποκτά το πολυπεπτίδιο, οπότε ονομάζεται πλέον πρωτεΐνη. Αυτή η αναδίπλωση πραγματοποιείται από την αλληλεπίδραση των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων (π.χ. σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ δύο κυστεϊνικών καταλοίπων).
Τέλος, υπάρχουν και πρωτεΐνες που αποτελούνται από πολλές πολυπεπτιδικές αλυσίδες που είναι χαλαρά ενωμένες και αυτό αποτελεί τη λεγόμενη "τεταρτοταγή δομή". Παράδειγμα είναι ηαιμοσφαιρίνη.
Επίσης στις πρωτεΐνες ανακαλύφθηκε και άλλο ένα επίπεδο οργάνωσης. Πρόκειται γιατηπρωτεϊνική επικράτεια - ή περιοχή - (protein domain), η οποία μπορεί να διπλωθεί ανεξάρτητα σεμια συμπαγή, σταθερή δομή. Μια περιοχή αποτελείται από 100 με 250 αμινοξέα και αποτελεί μονάδα από την οποία δομούνται πολύ μεγαλύτερες πρωτεΐνες. Οι διαφορετικές περιοχές σχετίζονται με διαφορετική λειτουργία.
Γενικά οι πρωτεΐνες ανάλογα της μορφής τους διακρίνονται σεινώδεις πρωτεΐνεςκαισεσφαιρικές πρωτεΐνες. Με κριτήριο τησύνθεσή τους διακρίνονται σεαπλές (όταν αποτελούνται μόνο από αμινοξέα) καισεσύνθετες (όταν στο μόριό τους περιλαμβάνονται καιμη πρωτεϊνικά τμήματα όπως μέταλλα, σάκχαρα, λίπηκ.λπ.).
Επίσης με κριτήριο ακόμη τηλειτουργία τους διακρίνονται σεδομικές (όταν αποτελούν τα δομικά υλικά του κυττάρου), καιλειτουργικές (όταν συμβάλλουν σε κάποιες λειτουργίες).
Οι διάφορες λειτουργίες που παρατηρούνται στους οργανισμούς γίνονται χάρη στις πρωτεΐνες. Οδε βιολογικός τους ρόλος καθορίζεται κάθε φορά από την τρισδιάστατη δομή τους που είναι συνέπεια της αλληλουχίας των αμινοξέων, η οποία και ξεκινά από την πρωτοταγή δομή.
Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα συστατικά στη διατροφή μας, δεδομένου ότι o άνθρωπος (όπως καιτα ζώα) δεν μπορεί να συνθέσει όλα τα αμινοξέα, αλλά πρέπει νατα λάβει από τα τρόφιμα. Μέσω της διαδικασίας της πέψης, αποικοδομείται η πρωτεΐνη στα ελεύθερα αμινοξέα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν γιατηνπρωτεϊνική σύνθεση
Υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία πρωτεϊνών, η κάθε μία με ξεχωριστή διαμόρφωση στο χώρο, η οποία οφείλεται στη διαφορετική αλληλουχία αμινοξέων τους, και ξεχωριστές ιδιότητες και τρόπο μετον οποίο δρουν. Γιανα γίνει η μελέτη τους, οι πρωτεΐνες πρέπει να απομονωθούν από το κυτταρικό διάλυμα στο οποίο βρίσκονται, κάτι που επιτυγχάνεται με ποικίλες διαδικασίες που καθαρίζουν τις πρωτεΐνες ώστε ναμην έχουν προσμίξεις. Στη συνέχεια μπορεί να βρεθεί η αλληλουχία της πρωτεΐνης μετη μέθοδο Edman, αλλά πρόσφατα σε αυτό το τομέα η χρήση τεχνικών τουανασυνδυασμένου DNA έχει προσφέρει νέες πληροφορίες. Στο προσδιορισμό της δομής μιας πρωτεΐνης πολύ χρήσιμη έχει αποδειχθεί η χρήση της φασματοσκοπίας πυρηνικού συντονισμού (NMR) καιη κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ. Τέλος, σημαντική γιατη κατανόηση της φυσιολογικής δράσης μιας πρωτεΐνης είναι ο εντοπισμός της στον οργανισμό.
Η μελέτη μιας πρωτεΐνης πρέπει να γίνει σε καθαρή πρωτεΐνη ώστε να προκύψουν σαφή συμπεράσματα. Έτσι η πρωτεΐνη πρέπει να απομονωθεί από το αρχικό υλικό, το οποίο μπορεί να είναι καλλιέργεια κυττάρων από φυτικούς η ζωικούς οργανισμούς. Ο καθαρισμός γίνεται με βάση πρωτόκολλα καθαρισμού.
Γιανα γίνει σωστά η απομόνωση πρέπει να υπάρχει μια δοκιμασία (essay) ώστε να επιβεβαιωθεί η παρουσία της πρωτεΐνης στο διάλυμα. Η δοκιμασία αυτή πρέπει να είναι όσο το δυνατό πιο εξειδικευμένη γιατη πρωτεΐνη που ψάχνουμε ώστε ο καθαρισμός να γίνει αποτελεσματικότερος. Ανη πρωτεΐνη είναι ένζυμο, τότε αυτή η δοκιμασία βασίζεται συνήθως στην αντίδραση που καταλύει. Επίσης χρήσιμη στο καθαρισμό είναι η γνώση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης που μπορεί να γίνει εύκολα καιμε ακρίβεια. Με βάση αυτά τα δύο μεγέθη μπορεί να υπολογιστεί η ειδική δραστικότητα, η οποία είναι ο λόγος της ενζυμικής δραστηριότητας προς τη συγκέντρωση όλων των πρωτεϊνών του διαλύματος. Όσο ο καθαρισμός προχωρά, η ενζυμική δραστηριότητα αυξάνεται.
Ο καθαρισμός αρχίζει μετηφυγοκέντρηση ενός ομογενοποιήματος, το οποίο αποτελείται κύτταρα χωρίς τηνκυτταρική μεμβράνη τους. Η φυγοκέντρηση γίνεται σε τρεις φάσεις στις οποίες χωρίζονται τα μέρη του κυττάρου. Σε κάθε φάση το υπερκείμενο φυγοκεντρείται ξανά σε μεγαλύτερη ταχύτητα για περισσότερη ώρα. Αυτή η διαδικασία λέγεται διαφορική φυγοκέντρηση και από αυτή προκύπτουν κλάσματα ελαττωμένης πυκνότητας. Αρχικά καθιζάνει το πυρηνικό κλάσμα μετά το μιτοχονδριακό κλάσμα και τέλος το μικροσωμικό κλάσμα, ενώ το υπερκείμενο της τελευταίας φυγοκέντρησης λέγεται κυτοσόλιο και περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες. Ένα κλάσμα από αυτά θα έχει μεγαλύτερη ενεργότητα και αυτό θα επιλεχθεί για περαιτέρω καθαρισμό.
Το κλάσμα που προέκυψε από τη φυγοκέντρηση περιέχει χιλιάδες διαφορετικές πρωτεΐνες. Γιανα γίνει απομόνωση της ζητούμενης πρωτεΐνης χρησιμοποιούνται τεχνικές που βασίζονται στα διακριτά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών, όπως είναι η διαλυτότητα, το φορτίο, το μέγεθος καιη αλληλεπίδραση με άλλες ουσίες λόγω χημικής συγγένειας. Σε κάθε στάδιο, το διάλυμα ελέγχεται γιατη παρουσία της πρωτεΐνης. Μια πρώτη διαδικασία που χρησιμοποιείται είναι ηεξαλάτωση. Οι περισσότερες πρωτεΐνες παρουσιάζουν μικρή διαλυτότητα σε υψηλή συγκέντρωση άλατος, αλλά η ποσότητα άλατος που απαιτείται γιατη απομάκρυνση της πρωτεΐνης από το διάλυμα, με αποτέλεσμα η εξαλάτωση να χρησιμεύει γιατη κλασμάτωση των πρωτεϊνών. Το περιττό άλας στη συνέχεια μπορεί να απομακρυνθεί μετη μέθοδο της διαπήδησης. Ο διαχωρισμός με βάση το μέγεθος γίνεται μεχρωματογραφία διήθησης σε πηκτή. Το μίγμα πρωτεϊνών διέρχεται μέσα από μια στήλη που περιέχει πορώδες πολυμερές. Μια μικρή πρωτεΐνη χρειάζεται περισσότερο χρόνο να διέλθει από το διάλυμα από μια μεγαλύτερη και έτσι οι πρωτεΐνες με διαφορετικό μέγεθος θα εκλουστούν σε διαφορετικούς χρόνους. Ο διαχωρισμός με βάση το φορτίο γίνεται με βάση το φορτίο γίνεται μεχρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Το μίγμα πρωτεϊνών διέρχεται από μια στήλη με φορτισμένα ιόντα (είτε θετικά είτε αρνητικά), ενώ βρίσκεται σεpH 7. Οι πρωτεΐνες φορτισμένες αντίθετα μετα ιόντα θα παραμείνουν μέσα στη στήλη, ενώ οι υπόλοιπες θα διέλθουν. Τέλος, ηχρωματογραφία συγγένειας βασίζεται στην υψηλή συγγένεια με μία χημική ουσία, με αποτέλεσμα όταν διέλθουν από μια στήλη πουτη περιέχει, η πρωτεΐνη να παραμείνει σε αυτή.
Γιανα καθοριστεί πόσο αποτελεσματικό είναι ένα πρωτόκολλο καθαρισμού υπάρχουν δύο τρόποι. Ο πρώτος είναι μετη συνεχή εξέταση της ειδικής δραστικότητας, η οποία αυξάνει όσο προχωρά ο καθαρισμός, καιο δεύτερος είναι μετη εξέταση των πρωτεϊνών που εμφανίζονται σε κάθε στάδιο του καθαρισμού. Το δεύτερο είναι δυνατό μιαηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, η οποία χωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση τουισοηλεκτρικό σημείοκαιτο μέγεθός τους.
Η γνώση της πρωτοταγούς δομής μιας πρωτεΐνης, δηλαδή η αλληλουχία των αμινοξέων, παρέχει χρήσιμα στοιχεία γιατη λειτουργία καιτην εξέλιξη μιας πρωτεΐνης. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των αμινοξέων αρχίζει μετο προσδιορισμός της σύστασης των αμινοξέων του πεπτιδίου. Η πρωτεΐνη υδρολύεταιμε θέρμανση σε διάλυμα υδροχλωρίου στους 110 βαθμούς Κελσίου γιαμια ημέρα. Τα υδρολυμένα αμινοξέα στη συνέχεια διαχωρίζονται με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής καιη ταυτότητα του αμινοξέως προσδιορίζεται από τον όγκο ρυθμιστικού διαλύματος που απαιτείται γιατην απομάκρυνσή του από τη στήλη. Στη συνέχεια, η ποσότητα του αμινοξέως προσδιορίζεται με αντίδραση νινυδρίνης. Το αμινοξύ θερμαίνεται μαζί μετη νινυδρίνη καιμεφασματοφωτομετρία μετράται η απορρόφησή του. Ηαπορρόφηση είναι ανάλογη μετη συγκέντρωση του αμινοξέως. Άλλες μέθοδοι είναι πιο ευαίσθητες, όπως η χρήση φθορεσκαμίνης, η οποία φωσφορίζει όταν αντιδρά με τις αμινικές ομάδες.
Το επόμενο βήμα είναι ο προσδιορισμός του αμινικού τελικού άκρου. Σήμερα αυτό γίνεται μετη χρήση ουσιών γνωστών ως dabsylκαιdansyl χλωρίδιο. Συγκεκριμένα, το dabsyl αλληλεπιδρά με μία μη φορτισμένη αμινική ομάδα και δημιουργεί ένα σταθερό παράγωγο σουλφαμιδίου, το οποίο δεν καταστρέφεται κατά τη υδρόλυση της πρωτεΐνης. Ανκαι αυτή η μέθοδος είναι ευαίσθητη και αποτελεσματική γιατο προσδιορισμό του αμινοτελικού άκρου, δε μπορεί να επαναληφθεί διότι η όξινη υδρόλυση της πρωτεΐνης προκαλεί την αποδιάταξή της. Γιατο προσδιορισμό της αλληλουχία τώρα χρησιμοποιείται ηαποικοδόμηση Edman. Το κύριο αντιδραστήριο αυτής της μεθόδου είναι τοφαινυλοϊσοθειοκυανικό, το οποίο αντιδρά μετο αμινοξύ που βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης και σχηματίζει ένα παράγωγο φαινυλο-θειοκαρβαμοϋλίου, και υπό ήπιες συνθήκες από τη πρωτεΐνη απελευθερώνεται ένα κυκλικό παράγωγο του τελικού αμινοξέως, η ένωση φαινυλο-υδαντοϊνο(PTH)-αμινοξύ. Στη συνέχεια ο κύκλος μπορεί να επαναληφθεί ξανά στο υπόλοιπο πεπτίδιο. Το PTH αμινοξύ αναγνωρίζεται μευγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης. Ο κύκλος αποικοδόμησης Edman μπορεί να αναγνωρίσει μέχρι 50 αμινοξέα. Γιανα προσδιοριστεί η αλληλουχία πρωτεϊνών με περισσότερα αμινοξέα, η πρωτεΐνη τεμαχίζεται σε μικρά κομμάτια με ενζυμικές και χημικές μεθόδους. Η αλληλουχία των αμινοξέων προσδιορίζεται μετη μέθοδο Edman, ενώ η σειρά των πεπτιδίων με βάση τα αλληλεπικαλυπτόμενα κομμάτια τους. Για πρωτεΐνες που αποτελούνται από πολλές αλυσίδες, πρώτα γίνεται ο προσδιορισμός του αριθμού των αλυσίδων, είτε μετρώντας αμινοτελικά άκρα, είτε με ηλεκτροφόρηση, και μετά η εύρεση της αλληλουχίας των αμινοξέων γίνεται για κάθε αλυσίδα ξεχωριστά.
Μια άλλη μέθοδος αφορά τη χρήση του DNA γιατο προσδιορισμό της αλληλουχία της πρωτεΐνης. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη κλωνοποιείται και έτσι μπορεί να βρεθεί η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του. Στη συνέχεια, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων αποκαλύπτει αμέσως την αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το γονίδιο. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι πολλές πρωτεΐνες τροποποιούνται μετά τη σύνθεσή τους στα ριβωσώματα, με αποτέλεσμα να εξακολουθεί να απαραίτητη η απομόνωση της πρωτεΐνης.
Οι δύο σημαντικότερες τεχνικές προσδιορισμού της δομής μιας πρωτεΐνης είναι η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού καιη κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ.
Η εντόπιση μιας πρωτεΐνης μέσα στο κύτταρο, και γενικότερα μέσα στον οργανισμό είναι το ίδιο σημαντική γιατη μελέτη της φυσιολογικής της δράσης μετον προσδιορισμό της αλληλουχίας αμινοξέων και της δομής της πρωτεΐνης. Γιατο εντοπισμό μιας πρωτεΐνης χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία προσδένουν την πρωτεΐνη μετην οποία εμφανίζουν συγγένεια. Τα αντισώματα αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη περιοχή της πρωτεΐνης, τοαντιγόνο, στην οποία και προσδένονται. Στη συνέχεια, ιχνηθετημένα με φθορίζουσες ή ραδιενεργές ουσίες αντισώματα προσδένουν στα πρώτα και επιτρέπουν τον εντοπισμό τους. Τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται ευρέως στις εργαστηριακές εξετάσεις επειδή είναι εξειδικευμένα, με αποτέλεσμα να συνδέονται με ένα μόνο αντιγόνο.
Υπάρχουν αρκετές τεχνικές που χρησιμοποιούν μονοκλωνικά αντισώματα γιανα εντοπιστεί μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται σε ένα διάλυμα, όπως για παράδειγμα ο ορός του αίματος, χρησιμοποιείται η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέτρηση (γνωστή εν συντομία ως ELISA). Μια διαφορετική μέθοδος γιατην ανίχνευση πρωτεϊνών στο κύτταρο ή σε ένα κυτταρικό υγρό είναι η ανοσοαποτύπωση ή αποτύπωση Ουέστερν (Western blotting). Σε αυτή τη τεχνική το διάλυμα ηλεκτροφορείται σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου καιγιανα αντιδράσουν πιο εύκολα μετο αντίσωμα μεταφέρονται σεμια άλλη επιφάνεια. Έπειτα, ένα δεύτερο ιχνηθετημένο αντίσωμα συνδέεται μετο πρώτο και βοηθά στον εντοπισμό του. Γιατην παρατήρηση πρωτεϊνών μέσα στο κύτταρα χρησιμοποιείται οανοσοφθορισμός. Φθορίζοντα αντισώματα προσδένονται στη πρωτεΐνη στόχο καιστη συνέχεια ένα μικροσκόπιο φθορισμού αποκαλύπτει τη θέση τους (άρα καιτη θέση της πρωτεΐνης) μέσα στο κύτταρο.
Το όνομα πρωτεΐνη προέρχεται από το ελληνικό "πρώτα", το οποίο σημαίνει "πρωταρχικής σημασίας" και περιγράφηκε αρχικά και ονομάστηκε από τονΓιονς Γιάκομπ Μπερτσέλιουςτο1838. Εντούτοις, ο κεντρικός ρόλος τους στους ζωντανούς οργανισμούς δεν εκτιμήθηκε πλήρως έως το 1926, όταν οΤζέιμς Σάμερ (James B. Sumner) έδειξε ότι το ένζυμο ουρεάση ήταν μια πρωτεΐνη. Η πρώτη πρωτεϊνική δομή, αυτή της μυοσφαιρίνης, βρέθηκε από τους Μαξ Πέρουτζ (Max Perutz) καιΤζον Κέντριου (John Kendrew) το1958, η οποία τους χάρισε τοβραβείο Νόμπελ στη Χημεία.
