再生さいせい医療いりょうのための幹みき細胞さいぼう凍害とうがい防止ぼうし保存ほぞん液えき

基盤きばん研究けんきゅう(B)

玄げん 丞すすむ烋  京都きょうと大学だいがく, 再生さいせい医い科学かがく研究所けんきゅうじょ, 准じゅん教授きょうじゅ (90283655)

17,680千せん円えん (直接ちょくせつ経費けいひ: 13,600千せん円えん、間接かんせつ経費けいひ: 4,080千せん円えん)

(目的もくてき)ヒト幹みき細胞さいぼうの臨床りんしょう応用おうようで安定あんていな細胞さいぼうの保存ほぞんは重要じゅうよう課題かだいの1つである。保存ほぞん剤ざいとして良よく使つかわれるDAP213はDMSOの細胞さいぼう毒性どくせいが無視むしできないため、代替だいたい物ぶつを用もちいた凍結とうけつ保存ほぞん液えきが望のぞましい。我々われわれはすでにDMSOを含ふくまない新規しんき不ふ凍こおポリアミノ酸あみのさん含有がんゆう保存ほぞん剤ざいでヒトiPS細胞さいぼうをガラス化か法ほうで凍結とうけつ保存ほぞんすることを報告ほうこくした。今年度こんねんどはこの保存ほぞん液えきがhES細胞さいぼうで同様どうようの保存ほぞん効果こうかが得えられるかを検討けんとうした。
(方法ほうほう)hES細胞さいぼうをコロニー状態じょうたいでカルボキシル化かPLLとEthylene glycolとSucroseを含ふくむ新規しんき凍結とうけつ保存ほぞん剤ざいで液体えきたい窒素ちっそ中ちゅうで急速きゅうそく凍結とうけつした。保存ほぞん後ご、再ふたたび解凍かいとうしSNLフィーダー細胞さいぼう上じょうで培養ばいよう後ご、細胞さいぼうの形態けいたい学がく的てき観察かんさつを行おこない、また未み分化ぶんか能力のうりょくの指標しひょうとなるアルカリホスファターゼ染色せんしょく、幹みき細胞さいぼうマーカーに対たいする免疫めんえき染色せんしょくを検討けんとうした。また核かく型がた解析かいせきを行おこない染色せんしょく体たいに異常いじょうがないかを確認かくにんした。
(結果けっか)不ふ凍こおポリアミノ酸あみのさんを含ふくむ凍結とうけつ保存ほぞん剤ざいで凍結とうけつしたhES細胞さいぼうは、DAP213(DMSO:Acetamide:Propylene Glycol=2:1:3)に比くらべると、コロニー状態じょうたいではDMSOを用もちいた保存ほぞん剤ざいの細胞さいぼうより不ふ凍こおポリアミノ酸あみのさん含有がんゆう保存ほぞん剤ざいの方ほうがコロニーの成長せいちょうが早はやく、細胞さいぼう数すうも2倍ばい近ちかくあった。マトリゲルコートディッシュに播種はしゅしたhES細胞さいぼうでも不ふ凍こおポリアミノ酸あみのさん含有がんゆう保存ほぞん剤ざいは翌日よくじつから細胞さいぼうの生なま着ちゃくが見みられたが、DAP213ではわずかしか生なま着ちゃくしなかった。不ふ凍こおポリアミノ酸あみのさん凍結とうけつ保存ほぞん剤ざいで保存ほぞんしたhES細胞さいぼうはアルカリフォスファターゼ染色せんしょくも正常せいじょうで、免疫めんえき染色せんしょくでは未み分化ぶんかマーカーは正常せいじょうに発現はつげんしていた。核かく型がた解析かいせきでも異常いじょうは認みとめられなかった。これよりhES細胞さいぼうにおいて新規しんき不ふ凍こおポリアミノ酸あみのさん含有がんゆう凍結とうけつ保存ほぞん剤ざいはDAP213に代かわり得えるものと確信かくしんできた。さらにhES細胞さいぼうの臨床りんしょう応用おうようを考かんがえると、将来しょうらい的てきには細胞さいぼうの凍結とうけつは緩慢かんまん凍結とうけつ法ほうが望のぞましく検討けんとうを重かさねていきたい。