(Translated by https://www.hiragana.jp/)
Proteoomika – Vikipeedia Mine sisu juurde

Proteoomika

Allikas: Vikipeedia

Proteoomika (ingl. k. proteomics) tähistab nii loodusteaduste haru, mis keskendub proteoomi (ehk valkude koosluse) uurimisele, kui ka teadustöös kasutatavate meetodite kogumit, mis võimaldab proteoomi eri viisidel ja keerukuse tasemetel uurida. Proteoomika kitsam tähendus on seotud massispektromeetrial põhinevate meetodite rühmaga, mis võimaldab tuvastada bioloogilises proovis tuhandeid valke.[1]

Seosed nn oomika-valdkondade vahel. Keemiline mitmekesisus: nukleiinhapped põhinevad 4 eri ehitusüksusel (nukleotiidid), valgud 20 eri ehitusüksusel (aminohapped), metaboliidid esindavad hinnanguliselt ligi 200 000 ainetüüpi. Üldistav skeem on koostatud mitme teadusartikli sarnaste jooniste põhjal[2][3][4].

Proteoomika kuulub muude nn oomika-valdkondade ja -tehnikate hulka (inglise keeles omics), olles seotud muuhulgas genoomika (keskendub pärilikkusinfole), transkriptoomika (keskendub pärilikkusinfo avaldumise vaheetappidele) ja metaboloomikaga (keskendub struktuurselt mitmekesisele väiksemate molekulide kogumile, mis on tekkinud ainevahetuse käigus). Võrreldes muude oomikatega, pakuvad proteoomikale huvi sellised biomolekulid, mis panevad vahetult paika organismi tunnuste komplekti ehk fenotüübi.[5]

Proteoomika uurimisküsimused

[muuda | muuda lähteteksti]

Proteoomika võib keskenduda erinevate proteoomiga seotud üksikasjade uurimisele, näiteks:[6]

  • Millal (nt organismi arengustaadiumite seisukohalt) ja mis koes ekspresseerub teatud valk või valkude kogum ning kuidas toimub ekspressiooni reguleerimine (nt transkriptsioonifaktorid või epigeneetilised mehhanismid);
  • Mis kiirusega toimub valgu tootmine või lagundamine ning mis neid protsesse käivitab/pidurdab;
  • Kuidas valku modifitseeritakse translatsioonijärgselt ning mil viisil modifitseerimine muudab valgu omadusi;
  • Kus valk paikneb raku sees ning kas see võib rakus ka ringi liikuda (nt olenevalt sellest, kas ensüüm on aktiveeritud või mitte);
  • Kas valku sekreteeritakse ning kui jah, siis mis vormis (nt „lõigatuna“ teatud proteaaside poolt või mitte) ja mil viisil (nt kas pakendatuna rakuvälistesse vesiikulitesse või mitte);
  • Milline on valgu roll organismis ning kuidas seda mõjutavad teised valgud ja muud molekulid (nt sekundaarsed virgatsained), jms.

Proteoomika metodoloogiline mitmekesisus

[muuda | muuda lähteteksti]

Proteoomika valdkonda kuuluvaid meetodeid saab liigitada mitmeti:[7]

  • Uuritava proovi keerukus ehk mitu eri valku võib proov sisaldada;
  • Korraga selektiivselt tuvastatav valkude (analüütide) arv;
  • Uuritava proovi agregaatolek: näiteks rakususpensioon või koetükk;
  • Mõõdetav suurus: valgu kontsentratsioon või valgu aktiivsus;
  • Uuritavas proovis sisalduvate valkude päritolu: kas tegemist on nn endogeensete ehk natiivsete valkudega (st vastavale uurimisobjektile omaste valkudega) või proovi sisse viidud modifitseeritud valkudega (näiteks fluorestsentsvalguga ühendatud rekombinantsed valgud).

Tabelis on loetletud näited proteoomika meetoditest, mis on detailsemalt kirjeldatud allpool:[8]

Süsteem* Mida mõõdetakse? Meetodite näited
Natiivne analüüt, natiivne maatriks Kõigi bioloogiliselt keerulises proovis sisalduvate valkude summaarne sisaldus Bradfordi meetod
Ühe kuni väga paljude (tuhandetes) analüütide sisaldus bioloogiliselt keerulises proovis (proov jaotatakse väiksemateks fraktsioonideks) Kromatograafia või geel-elektroforees, millele järgnevad massispektromeetria-tehnikad
Ühe kuni mitme (kümnetes) analüütide sisaldus bioloogiliselt keerulises proovis (proov jaotatakse väiksemateks fraktsioonideks) Geel-elektroforees, millele järgneb immunoloogiline kapillaarülekanne (ingl k Western blot)
Voolutsütomeetria
Ühe kuni mitme (kümnetes) analüütide sisaldus bioloogiliselt keerulises proovis ilma proovi fraktsioneerimiseta Immunoensüümmeetod (ingl k enzyme-linked immunosorbent assay ehk ELISA)
Ühe kuni mõne analüüdi sisaldus või paiknemine (lokalisatsioon) bioloogiliselt keerulises proovis Immunohistokeemia (IHC) ja immunotsütokeemia (ICC), millele järgneb optiline mikroskoopia
Ühe kuni mõne analüüdi sisaldus või aktiivsus bioloogiliselt keerulises proovis Radioaktiivse või fluorestseeruva märgisega ligande kasutavad sidumismeetodid
Mittenatiivne analüüt on natiivses süsteemis Ühe kuni mõne „erimärgistusega“ analüüdi sisaldus või paiknemine (lokalisatsioon) bioloogiliselt keerulises proovis Fluorestsentsmikroskoopia elusrakkudes, vaatlemaks fluorestsentsvalguga ühendatud vms rekombinantseid konstrukte
Mittenatiivne analüüt on lihtsustatud maatriksis Analüüdi iseloomustamine pärast eraldamist keerulisest maatriksist Rekombinantse valgu tootmine sobivas mudelsüsteemis (teatud tüüpi rakukultuuris)
Toodetud valgu puhastamine afiinsus- või suuruseraldus-kromatograafiaga vms
Valgu struktuuri iseloomustamine: nt kristallograafia koos röntgendifraktsiooniga, tuumamagnetresonantsspektroskoopia (TMR ehk NMR) vms
Valgu funktsionaalne iseloomustamine: nt biokeemilised meetodid ensüümi katalüütilise aktiivsuse või retseptori signaaliraja käivitamise mõõtmiseks vms

*Maatriksiks nimetatakse siinkohas proovi kõiki muid komponente, mis ei ole analüüt ehk uuritav valk.

Valkude summaarse kontsentratsiooni määramine

[muuda | muuda lähteteksti]
Värvi Coomassie Brilliant Blue G-250 struktuur
Eksperimentaalselt mõõdetud andmed (plaadilugeja Biotek Cytation 5, lahuse ruumala 150 μみゅーL): mida suurem on valgusisaldus lahuses (vt legend joonise all), seda suurem on Coomassie neelduvus 595 nm juures

Valkude kogusisalduse määramiseks kasutatakse enamasti kolorimeetrilisi ehk lahuse värvimuutusel põhinevaid meetodeid, kus värvaine neelduvus teatud nähtava ala lainepikkuse juures (mida inimsilm tunnetab värvina) oleneb valgusisaldusest lahuses. Üks tuntumaid ja tehniliselt lihtsamaid lahendusi on nn Bradfordi meetod, kus kesksel kohal on värvaine Coomassie Brilliant Blue G-250. Happelises keskkonnas on selle värvaine kahe suhteliselt nõrga neeldumismaksimumiga (465 nm ja 645 nm), kuid lisamisel valgulahusesse moodustab see mittekovalentset kompleksi valkude positiivselt laetud aminorühmadega ja aromaatsete aminohappejääkide külgrühmadega. Sellega kaasneb värvi neeldusmisspektri maksimumi muutumine: värvi kompleks valguga neelab tugevalt 595 nm juures, andes lahusele iseloomuliku sinise värvuse.[9] Beeri-Lamberti seaduse kohaselt on neelduvus võrdelises sõltuvuses kompleksi kontsentratsiooniga (kui kontsentratsioon ei ole liiga madal ega liiga kõrge), mistõttu lahuse valgusisaldust saab tuvastada, mõõtes lahuse neelduvust 595 nm juures. Kuna Bradfordi meetod on tundlik proovi maatriksi komponentide suhtes, kasutatakse mõõtmistes sageli kalibratsioonigraafikut, mõõtes valguse neelduvust kõigepealt tuntud valgusisaldusega proovides, millele on lisatud Coomassie Brilliant Blue G-250. Enamasti kasutatakse kalibreerimiseks mõnda hästi kättesaadavat odavat valku (nt veise seerumi albumiin), kuigi see ei pruugi analüüsitava valkude segu omadusi täpselt modelleerida.[10] Nagu kõik kolorimeetrilised meetodid, ei ole Bradfordi meetod ühilduv häguste proovidega (suspensioonid jms), kuna valguse hajumine tingib neelduvuse näiliselt kõrgemat väärtust.[11]

Vaatamata oma piirangutele, on Bradfordi meetodi lihtsus (kvalitatiivne hinnang on võimalik ka visuaalse vaatluse teel), kiirus (mõõtmised on teostatavad mõne minutiga) ja tundlikkus (meetodiga saab määrata valgusisaldust suurusjärgus 2–20 μみゅーg/mL) teinud seda väga populaarseks. 2. detsembri 2022 seisuga on teaduskirjanduse andmebaasi Clarivate Analytics Web of Science info kohaselt Marian M. Bradfordi originaalpublikatsioonile[12] viidatud peaaegu 240 000 korda[13]. Kliinilistest rakendustest saab Bradfordi meetodit kasutada uriiniproovide valgusisalduse analüüsiks: tavaliselt peaks valgusisaldus uriinis olema suhteliselt väike (alla 150 mg valku päevas), kuid neerude halvenenud funktsiooni korral võib see oluliselt tõusta (makroproteinuuria korral üle 300 mg valku päevas ehk üle 150 mg valku liitri uriini kohta).[14] Oluliselt laialdasem on aga Bradfordi meetodi kasutamine baasteaduslikes uuringutes, võrdlemaks valkude kogusisaldust proovides, mis erinevad suuruselt oluliselt (näiteks eri patsientide biopsiaproovides) – sel viisil on võimalik teostada järgnev katseseeria viisil, kus võetakse arvesse proovi suhtelisest suurusest tingitud erinevusi.[15][16]

Veel üks kolorimeetriline meetod, mille abil saab määrata valkude kogusisaldust homogeenses proovis, on nn Lowry meetod. See meetod kasutab värvainena nn Folini-Ciocalteu reagenti (fosfomolübdaadi ja fosfovolframaadi segu), mis moodustab värvilisi kompleksi valgu koosseisu kuuluvate aminohappejääkidega Cys, Trp ja Tyr. Seejuures peavad need aminohappejäägid olema eelnevalt oksüdeeritud, mis saavutatakse eelnevalt Cu2+ ioonide toimel aluselises keskkonnas (vaseioon redutseerub oksüdatsiooniastmeni +1).[17][18] Ka see meetod on väga populaarne: 2. detsembri 2022 seisuga on Oliver H. Lowry originaalsele publikatsioonile[19] viidatud teaduskirjanduse andmebaasi Clarivate Analytics Web of Science info kohaselt kokku üle 350 000 korra.[20]

Dialüüsi põhimõte: vasakpoolsel pildil on näidatud süsteem katse alguses ja paremal pildil tasakaaluolekus. Siniste kujunditena on näidatud puhastatav valk, punaste kujunditena puhverlahuse komponendid ja rohelisena madalamolekulaarne lisand algses valguproovis, mille kontsentratsiooni soovitakse vähendada.

Proovi eeltöötlus

[muuda | muuda lähteteksti]

Kuigi mõned allpool käsitletud meetoditest kasutavad proovina terveid rakke või isegi koetükke, on paljude meetodite puhul (nt kromatograafia, elektroforees, mõned ELISA rakendused jms) enamasti vajalik bioloogilise proovi täiendav ettevalmistus. See võib koosneda mitmest etapist, mis hõlmavad näiteks järgmisi võtteid:[21][22][23]

  • Ebaühtlase ehk mittehomogeense (nt tahkest ja vedelast osast koosneva) proovi homogeniseerimine mehaanilise peenestamise abil või kasutades ultraheli.
  • Proovi jaotamine osadeks, kasutades sadestamist ja tsentrifuugimist – näiteks membraansed struktuurid või suured DNA molekulid lahustuvad veepõhistes puhverlahustes halvemini kui tsütosoolsed valgud; seevastu atsetonitriilis valgud ei lahustu, kuid orgaanilisse faasi liiguvad väiksema molekulmassiga hüdrofoobsed ained. Tsentrifuugimisel lahutatakse lahustuv osa mittelahustuvast, kasutades ära tiheduste erinevusi.
  • Ekstraheerimise ja kromatograafia vahepealne tehnika, kus kasutatakse hüdrofoobsetest (pikkade alküülahelatega derivatiseeritud) materjalidest valmistatud filtritega pipetiotsikuid – proovi pipeteerimisel kinnituvad hüdrofoobsemad komponendid filtri külge ning hüdrofiilsemad jäävad lahusesse.
  • Dialüüs, kasutades poorseid membraane – viimased võimaldavad väikese molekulmassiga molekulidel difusiooniliselt liikuda dialüüsitava lahuse ja suurema ümbritseva lahuse (dialüsaadi) vahel kuni kontsentratsiooni ühtlustumiseni, kuid suure molekulmassiga molekulid (nt valgud) jäävad membraaniga ümbritsetud alasse.
  • Lüofiliseerimine ehk külmkuivatus, kus proovi hoitakse madalal temperatuuril vaakumis. Madala rõhu tingimustes lahkuvad proovist lenduvad ja madalama keemistemperatuuriga komponendid (enamasti sealhulgas ka vesi) ning valgud säilitavad samas madalal temperatuuril suurema tõenäosusega oma ruumilist struktuuri. Lüofiliseerimine on pehme viis, tõstmaks proovis valgusisaldust, kuid see ei sobi mittelenduvaid soolasid sisaldavate proovide jaoks ning ei garanteeri siiski näiteks ensümaatilise aktiivsuse säilimist lüofiliseeritud proovis (isegi pärast proovi taaslahustamist vees).

Lahutamistehnikad: kromatograafia liigid

[muuda | muuda lähteteksti]
Kolonnkromatograafia üldpõhimõte: mustade täppidena on näidatud statsionaarne faas, neoonsinisena mobiilne faas, sinise ja punase triibuna lahutatavad ained (mis esialgu moodustavad lillaka segu).
Meeldetuletuseks: valkude struktuuri eri tasemed, primaarsest (üleval) tertsiaarseni (all). Näitena on kasutatud valgu PCNA kristallstruktuuri.

Kromatograafia on väga mitmekesiste meetodite kogum, mis on üldiselt kasutatavad eri komponentide lahutamiseks segude analüüsil. Neid meetodeid ühendab asjaolu, et komponentide lahutuseks kasutatakse kaks eri faasi (statsionaarne ehk mitteliikuv ning mobiilne ehk liikuv), kusjuures lahutamine toimub tänu sellele, et eri komponendid püsivad eelistatult kas statsionaarse faasi külge kinnitununa või mobiilses faasis lahustununa. Statsionaarne faas võib olla kas kahemõõtmeline (nn planaarkromatograafia) või kolmemõõtmeline (nn kolonnkromatograafia) ning lahutus on üldiselt seda efektiivsem, mida rohkem on võimalik meetodi disainis võimaldada analüüdi üleminekuid statsionaarse ja mobiilse faasi vahel (kasutades nt poorseid või peeneteralisi täidiseid statsionaarse faasina). Mobiilne faas võib aga olla kas vedelas või gaasilises agregaatolekus.[24] Proteoomikas kasutatakse enamasti kõrgrõhu-vedelikkromatograafiat (ingl k high-pressure liquid chromatography või ka high-performance liquid chromatography ehk HPLC), kus vedelat mobiilset faasi surutakse läbi peeneteralise täidisega täidetud kolonnist. Ultra-HPLC puhul kasutatakse näiteks rõhku üle 1000 atmosfääri ning kolonni täidise suurus on mikromeetri suurusjärgus.[25] Vastastikmõjude tüüpe, mis tagavad lahutatavate komponentide kinnitumist statsionaarse faasi külge, on mitmeid:[26][27]

  • Aine hüdrofiilsus/hüdrofoobsus: polaarsemad ained püsivad pikemat aega polaarsemas faasis, vähem polaarsemad vastavalt vähem polaarses faasis. Kuna valgud on suhteliselt suure molekulmassi ning keerulise ruumilise kujuga molekulid, teostatakse sageli enne analüüsi valgu denatureerimine (ruumilise struktuuri lagundamine tingimustes, kus primaarstruktuur jääb alles) ning seejärel osaline proteolüüs suure puhtusega proteaasidega (nt trüpsiiniga). Kuigi valgud ja nende lagundamisel saadavad peptiidid on üsna polaarsed, oleneb nende hüdrofiilsus ja hüdrofoobsus siiski molekuli moodustavate aminohappejääkide külgahelas olevates funktsionaalrühmadest. Proteoomikas kasutatakse enamasti nn pöördfaas-kromatograafiat (ingl k reverse-phase high-pressure liquid chromatography ehk RP-HPLC), kus statsionaarne faas on vähepolaarne ning mobiilne faas polaarne. Kuna lisaks valkudele võivad bioloogilised proovid sisaldada suures hulgas väiksemaid molekule, mis võivad raskendada RP-HPLC protsessi või peptiidi hilisemat tuvastamist ning kuna RP-HPLC kolonne soovitakse võimalikult kaua korduvkasutada, tehakse enne RP-HPLC-d sageli proovi eelnev põhjalik eeltöötlus.[28]
  • Molekuli suurus: kuigi valgumolekuli ruumilised mõõtmed sõltuvad nii primaarsest struktuurist (ehk mitu aminohappejääki valk sisaldab) kui ka kõrgemat järku struktuuridest (ehk kuidas valgumolekul voltub), saab valkude segus teostada teatud lähenduses komponentide „sorteerimist“ suhtelise suuruse järgi, kasutades poorseid täidiseid või membraane. Suuruseralduskromatograafia (ingl k size exclusion chromatography ehk SEC) puhul liigub lahutatavate valkude segu läbi poorse täidisega kolonni, kusjuures väiksema molekulmassiga valgud jäävad pooridesse pikemaks ajaks „lõksu“ ning seepärast väljuvad kolonnist hiljem kui suurema molekulmassiga valgud, mis pooridesse ei mahu. Saavutatav lahutus on siiski suhteline ning eri tüüpi valkude eraldamiseks tuleb teostada meetodi eelnev optimeerimine, kasutades teadaolevate molekulmassidega võrdlusaineid. Mõnevõrra sarnaneb sellega ultrafiltreerimine (UF), kuid selle puhul kasutatakse poorseid membraane ning seejuures toimib membraan filtrina, lastes läbi vaid teatud piirmäärast väiksemaid molekule. Nii SEC kui ka UF puhul kasutatakse protsessi kiirendamiseks sageli süsteemi tsentrifuugimist, kus proov „surutakse“ läbi kolonni/membraani tsentrifugaaljõu toimel.[29][30][31][32]
  • Molekuli võime moodustada spetsiifilisemaid suunatud vastastikmõjusid: enamik valkudest peab oma rolli täitmiseks organismis moodustama vastastikmõjusid teiste valkudega ning muude molekulidega – seejuures tekib unikaalne vastastikmõjude muster, mille alusel saab eristada sobivat sidumispartnerit mittesobivast. Seda omadust kasutatakse ära afiinsuskromatograafias, kus statsionaarse faasi külge kinnitatakse huvipakkuva valgu mõni sidumispartner (näiteks proteiinkinaasi A eraldamiseks saab kasutada selle looduslikku termostabiilset inhibiitorit PKI). Tulemuseks moodustab statsionaarse faasiga tugevaid vastastikmõjusid eelistatult huvipakkuv valk ning suurem osa muudest proovi komponentidest läbib kolonni üsna kiirelt, statsionaarse faasiga vastastikmõjusid peaaegu moodustamata. Järgnevaks sammuks on huvipakkuva valgu eemaldamine kolonnist (elueerimine), milleks kasutatakse erinevaid mooduseid – igal juhul tuleb aga nõrgendada vastastikmõjusid valgu ja selle sidumispartneri vahel. Selleks võib muuta mobiilse faasi pH väärtust, ioontugevust või lisada mobiilsele faasile mõnda ainet, mis võib samuti huvipakkuva valguga vastastikmõjusid moodustada, pakkudes sel viisil konkurentsi statsionaarse faasi omadustele (näiteks proteiinkinaas A elueerimiseks PKI-afiinsustäidisest kasutatakse arginiini lisamist mobiilsesse faasi, mis konkureerib PKI-ga). Samuti võib statsionaarse faasi külge kinnitada näiteks antikehi, mis seovad selektiivselt just sihtmärkvalku.[33][34][35]
SEC-i saab kasutada ka valguproovidest soolade jms väikese molekulmassiga ainete eraldamiseks (ehk siis proovi eeltöötluse ühe osana). Suure kollase ringina on näidatud puhastatav valk ja väikese punase ringina eemaldatav lisand.

Kromatograafiat teostatakse kas analüütilistel (st tuvastada segus sisalduvate komponentide arvu ja olemust) või preparatiivsetel (st füüsiliselt eraldada üks komponent teistest) eesmärkidel. Näiteks on RP-HPLC proteoomikas enamasti analüütilise, aga suuruseralduskromatograafia ja afiinsuskromatograafia vastupidi preparatiivse eesmärgiga. Seepärast on vaja kromatograafiat enamasti kombineerida erinevat tüüpi detektoritega (seadmetega, mis mõõdavad kolonni väljundis teatud signaali). Olenevalt konkreetsest meetodist võivad selleks sobida kas optilised detektorid (nt dioodrivi, mis registreerib ultravioletse ja nähtava ala elektromagnetkiirguse neeldumist kolonnist väljuvas lahuses) või massispektromeetrilised detektorid (registreerivad kolonnist väljuvas lahuses sisalduvate molekulide ioniseerumisel tekkivate osakeste massi ja laengu suhet ehk m/z väärtust). Analüütilises proteoomikas kasutatakse enamasti just massispektromeetrilised detektoreid, kuna nende suure lahutusvõime tõttu on osakese jaoks tuvastatava m/z väärtuse põhjal võimalik suure täpsusega prognoosida osakese brutovalemit. Preparatiivses proteoomikas on üheks lähenemiseks ka mitmete kolonnist väljunud lahuseportsude (fraktsioonide) kogumine, kust hiljem ohverdatakse osa muude meetodite jaoks (nt Coomassiega värvimine, vt alapealkiri eespool), mis võimaldavad kindlamalt tuvastada analüüdi olemasolu igas kogutud fraktsioonis.[36][37]

Valkude uuringute teostamiseks on kromatograafilisi meetodeid täiustatud ja kombineeritud omavahel ja teiste tehnikatega eri viisidel, mis võimaldavad:

A) vähendada kasutatava proovi kogust (see on oluline näiteks patsientide proovidega töötamisel, kus bioloogilise materjali koguhulk võib olla piiratud mõne milligrammiga),[16][38]

B) kiirendada analüüsi (kümne proovi skaalal ühe ööpäeva jooksul, kusjuures igas proovis tuvastatakse tuhandetele valkudele vastavaid peptiide)[39] ning

C) tuvastada analüüte, mille sisaldus proovis on väga väike (0,1–10 pikogrammi ühe milliliitri algse proovi kohta)[40].

Lahutamistehnikad: elektroforees

[muuda | muuda lähteteksti]
Lihtsustatud käsitlus SDS seostumisest valgumolekuliga. SDS on detergent, mille koostisse kuulub hüdrofoobne alküülahel ja hüdrofiilne sulfaatrühm.

Valkude segu saab lahutada ka geelelektroforeesi abil, kasutades laetud molekulide liikumist elektriväljas läbi poorse polüakrüülamiidist koosneva geeli (ingl k polyacrylamide gel electrophoresis ehk PAGE). Seejuures saab ära kasutada kas valgumolekulide „olemuslikku“ laengut, mis tuleneb mõnede aminohappejääkide külgahelates ja valgumolekuli terminaalides paiknevatest laetud funktsionaalrühmadest, või anda valgumolekulidele lisalaengut, kasutades pindaktiivset ainet naatriumdodetsüülsulfaati (ingl k sodium dodecylsulphate, SDS).[41] PAGE jaoks kasutatav elektrivälja tagav seade on sisuliselt elektrolüüser: välise energiaallika abil tekitatakse seadme ühel elektroodil (anoodil) positiivne ja teisel elektroodil (katoodil) negatiivne laeng[42].

1D-elektroforees

[muuda | muuda lähteteksti]
1D-PAGE skemaatiline käik. Vasakul on näidatud elektrolüüsiks kasutatav seade.

Ühemõõtmelise PAGE puhul segatakse valke sisaldav piisavalt homogeenne proov SDS-iga. SDS seostub valgumolekuliga, lineariseerides seda (denatureerimise teel) ning andes iga aminohappejäägi kohta võrdse arvu negatiivseid laenguid (keskkonna pH juures, mis jääb vahemikku 6,8–8,8). Valgumolekulide denatureerimisele aitab kaasa ka proovi eeltöötlus kõrgel temperatuuril (75–95 °C) ning redutseerivate ainete (nt tioolide) lisamine, mis taandavad ära molekulisisesed ja molekulidevahelised disulfiidsidemed. Negatiivselt laetud valkude segu pannakse seejärel elektrivälja toimel liikuma läbi poorse geeli positiivselt laetud elektroodi poole: väiksema molekulmassiga valgud liiguvad seejuures pooridest läbi kiiremini kui suuremad. Lahutumisele aitavad kaasa ka geelis ja foreesipuhvris sisalduvad komponendid (nt trisaminometaan ehk Tris ja glütsiin). Tulemusena saavutatakse valkude segu lahutumine vastavalt molekulmassile. 1D-PAGE järel saab valgumolekule asukohta geelis visualiseerida valke siduva värvaine Coomassie abil (vt eespool alapealkiri „Valkude summaarse kontsentratsiooni määramine“). Ühte kindlat huvipakkuvat valku saab samuti tuvastada PAGE jooksul lahutatud valkude ülekandmise järel õhemale membraanile (membraani materjaliks on kas nitrotselluloos või polüvinülideenfluoriid), millele järgneb värving selektiivse antikehaga.[43][44]

Värviga Coomassie "ilmutatud" geelid 1D-PAGE järel. Valgud on nähtavad vöötidena.

2D-elektroforees

[muuda | muuda lähteteksti]
DIGE tulemused: kombinatsioon kahest fluorestsentskanalist (fotol näidatud rohelise ja punasena). Kollane värv tekib kohtades, kus asuvad valgud, mis leiduvad mõlemas proovis. Valgud on nähtavad laikude või täppidena.

Kahemõõtmelise PAGE puhul toimub lahutamise esimeses etapis valkude segu liikumine elektrivälja toimel läbi polüakrüülamiidist geeliriba, mille eri piirkondadele on omane erinev pH (pH väärtuste sujuva ülemineku tagamiseks lisatakse geeli valmistamisel segusse segu polüaminokarboksüülhapetest, mis omavad erinevat happelisust[45]). Seda lähenemist nimetatakse ka isoelektriliseks fokuseerimiseks. Meetodi läbiviimisel kasutatakse ära asjaolu, et valgumolekuli koosseisu kuuluvad karboksüülrühmad ja aminorühmad võivad vastavalt oma happelisus-aluselistele omadustele olenevalt keskkonna pH-st kas deprotoneeruda või protoneeruda. Seejuures on iga valgumolekuli puhul olemas iseloomulik pH väärtus (nn isoelektriline punkt ehk pI), mille juures valgumolekuli summaarne laeng on võrdne nulliga. Kui valgumolekul jõuab geeliribast läbimineku jooksul asukohta, mille pH on võrdne valgumolekuli pI-ga, siis valgumolekul edasi ei liigu. Sel viisil saavutatakse esmalt valkude segu lahutumine vastavalt sellest sisalduvate aminohappejääkide happeliste või aluseliste omaduste ülekaalule.[46]

Isoelektrilise fokuseerimise järel asetatakse ühes mõõtmes lahutatud valkudega geeliriba SDS-sisaldava polüakrüülamiidgeeli sisse ning lastakse SDS molekulidel valkudega seostuda. Seejärel teostatakse valkude segu lahutamine vastavalt molekulmassile, kasutades SDS-iga seotud valkude liikumist suunas, mis on risti, võrreldes isoelektrilise fokuseerimise suunaga. Seega sarnaneb 2D-PAGE teine etapp 1D-PAGE põhimõttega.[47]

2D-PAGE üldskeem. Üleval on näidatud isoelektrilise fokuseerimise etapp ja all SDS-abistatud teine etapp (lahutamine molekulmasside alusel: molekulmasside kasvu järjekord saadud geelil on tähistatud noolega joonise paremas osas).

Kuigi 2D-PAGE järel saaks lahutatud valke visualiseerida sarnaselt 1D-PAGE puhul mainitud lähenemistega, kasutatakse 2D-PAGE sageli nn geelisiseselt eristava elektroforeesi (ingl k differential in-gel electrophoresis) ehk DIGE-formaadis. DIGE-formaat võimaldab korraga lahutada kahest võrreldavast proovist pärit valke, kuna enne elektroforeesi teostatakse valgumolekulide kovalentne ühendamine fluorestsentsvärviga (seejuures kasutatakse kahe eri proovi jaoks erinevate optiliste omadustega värve, nt Cy3 ja Cy5). On oluline, et fluorestsentsvärvid ei muuda oluliselt lahutatavate valkude happelis-aluselisi omadusi ega molekulmassi. Seega saab 2D-PAGE järel saab võrrelda, kas geeli ühes piirkonnas esineb mõlema fluorestsentsvärvi signaal (sel juhul sisaldasid mõlemad proovid sellist valku, mille pI ja molekulmass võimaldasid molekulil 2D-PAGE käigus just antud asukohta jõuda) või ülekaaluliselt ainult ühe fluorestsentsvärvi signaal (sel juhul sisaldub huvipakkuv valk suuremas kontsentratsioonis ühes proovidest). Võrdluse tulemusena selgunud huvipakkuvaid valke saab seejärel täpselt tuvastada, kasutades massispektromeetriat.[48][49]

Ülevalt alla või alt üles-tüüpi proteoomika töövoo võrdlus

Massispektromeetria proteoomi uuringutes

[muuda | muuda lähteteksti]

Massispektromeetria võimaldab lahutada gaasifaasis viibivaid ioone, kasutades ioonide liikumist magnetväljas, kuna iooni trajektoori pikkus ja/või kuju oleneb selle massi (m) ja laengu (z) suhte väärtusest. Kuivõrd kõrglahutusega massispektromeeter on suuteline tuvastama m/z väärtusi täpsusega kolm-neli kohta pärast koma (daltoni skaalal), siis sisuliselt on mõõdetud signaalide alusel võimalik kindlaks teha tuvastatud ioonide brutovalemid, sest süsteem on piisavalt tundlik, et eristada omavahel sama elemendi isotoope. Olenevalt konkreetsest proovist ja uurimistöö eesmärgist, kasutatakse proteoomikas nii ionisatsioonimeetodeid (elektropihustus e ESI, abimaatriksiga laserdesorptsioon e MALDI) kui ka massianalüsaatoreid (kvadrupool e Q, ioontsüklotron-resonants e ICR, lennuaeg e TOF). Valkude massispektromeetrilisel analüüsil lagundatakse valgud sageli eelnevalt peptiidideks, kuigi teatud meetodid võimaldavad lihtsamates proovides kindlaks teha ka lagundamata molekuli protoneerumisel tekkivate molekulaarioonide m/z väärtusi. Lihtsustamaks peptiidi aminohappelise järjestuse määramist, kasutatakse ka analüüsitud peptiidide edasist fragmenteerimist otse massispektromeetris, tekitades sellega peptiidist terve komplekti lühemaid ioone, mille m/z väärtuste alusel on võimalik tuvastada üksikuid aminohappejääke ja nende järjestikust paiknemist peptiidis. Sel viisil on massispektromeetria asendanud valkude ja peptiidide sekveneerimisel ajaloolist Edmani meetodit. Tuvastamaks valke, millest identifitseeritud järjestusega peptiidid pärinevad, kasutatakse proteoomika andmebaase (nt UniProt).[50][51][52][53][54]

Massispektromeetriale eelneva proovitöötluse alusel võib proteoomikas eristada kaht põhilist lähenemist:[52][55][56]

  • Nn alt üles (ingl k bottom-up) lähenemine – bioloogiline proov (nt rakud, kude vms) homogeniseeritakse, rikastatakse valgusisalduse poolest ning valgud lagundatakse proteolüütiliselt (nt trüpsiini abil). Saadud peptiidide segu süstitakse kromatograafi, kust lahutatud peptiidid suunatakse edasi ESI-massispektromeetrisse. Sel viisil teostatakse suur osa nn märgistamata analüüsidest (ingl k label-free proteomics), st valke ei derivatiseerita täiendavalt. Sama valgu sisaldust eri proovides on võimalik kvantitatiivselt võrrelda, kui teha igas proovis kindlaks huvipakkuvale valgule vastava signaali intensiivsuse suhet kõigi proovis tuvastatud signaalide intensiivsusesse. Samas proovis ei ole eri valkude sisaldus samas võrreldav, sest eri peptiidid ioniseeruvad erineva efektiivsusega.
  • Nn ülevalt alla (ingl k top to bottom) lähenemine – bioloogiline proov (nt rakud, kude vms) homogeniseeritakse, suurendatakse selle valgusisaldust ning valkude segu lahutatakse 2D-elektroforeesi teel. Saadud geelist saab välja lõigata riba, milles prognoositavalt (arvutuslikult või varem eksperimentaalsel teel määratud isoelektrilise punkti ja molekulmassi alusel) asub huvipakkuvale valgule vastav „laik“. Seejärel ekstraheeritakse valk geelist ning suunatakse massispektromeetrilisse analüüsi. Sel viisil teostatakse sageli paralleelselt mitme proovi analüüs, kusjuures enne geelelektroforeesi märgistatakse proovides valgud märgistamine fluorestsentsvärvidega (iga proovi jaoks valitakse eristuvate spektraalomadustega värv, et geeli peal saaks kindlaks teha, milliste „laikude“ intensiivsused on eri proovides oluliselt erinevad).

Olenevalt uurimistöö eesmärgist ja kättesaadava proovi hulgast saab kasutada ka täiendavaid meetmeid, tagamaks massispektromeetrilise analüüsi täpsust. Näiteks juhul, kui tahetakse keskenduda ainult teatud translatsioonijärgse modifikatsiooniga valkude analüüsile, saab proovi eelnevalt rikastada, kasutades afiinsuskromatograafiat või puhastamist titaandioksiidi osakestega (fosforüülitud valkude jaoks). Analüüsi kvantitiivsuse ja tundlikkuse suurendamiseks saab valke derivatiseerida – kas staadiumis, kus valgud on kasvavates rakkudes (kasutades isotooprikastatud söötmeid) või homogeniseerimise järel (kasutades nn isobaarseid märgiseid, ingl k isobaric tags).[57][58][59][60][61]

Näide vereproovi voolutsütomeetrilisel analüüsil saadud graafikust. SSC-H tähistab külgsuunas hajumist, FSC-H otsesuunas hajumist ja värvikoodi abil on näidatud objektide hulk (kuna üksikuid täppe on graafikul keeruline eristada, kui need paiknevad üksteise kõrval). Iga täpp on üks mõõdetud objekt (vererakk).

Voolutsütomeetria

[muuda | muuda lähteteksti]

Voolutsütomeetria näol on tegemist meetodiga, mis vaatleb valke rakkude kontekstis. Uuritavaks prooviks on rakkude suspensioon, milles rakud võivad püsida ka elusana (ehk meetod ei vaja bioloogilise terviklikkuse kaotamist). Rakususpensioon juhitakse läbi klaaskapillaari, mille peensus võimaldab saavutada olukorda, kus kapillaarist läbivoolava vedeliku teatud ruumalas (ligi 10–9 liitrit) saab korraga viibida ainult üks rakk. Osale kapillaarist fokusseeritakse laseri valgus ja registreeritakse tekkinud valgustäpis (ligi 50–60 μみゅーm läbimõõduga) koos vedelikuga kapillaari läbivate rakkude omadusi. Selleks mõõdetakse valguse hajumist kahes sihis: nn otsehajumine (ingl k forward scatter) ja hajumine külgsuunas (ingl k side scatter).[62][63][64]

Otsehajumist mõõtev detektor registreerib seda suuremat signaali muutust, mida suurem objekt kapillaari läbib (sest suur objekt takistab laseri valguse jõudmist detektorisse). Külgsuunas hajumist mõõtev detektor registreerib seda suuremat signaali muutust, mida granulaarsem objekt kapillaari läbib (sest granulaarne objekt hajutab laseri valgust külgsuundades). Lisaks sellele kuuluvad mitmete voolutsütomeetrite koosseisu ka detektorid fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmiseks. Need on kasulikud juhul, kui rakkude sisse või pinnale on lisatud fluorestseeruvad komponendid – kas geneetiliste modifikatsioonide tulemusena (nt fluorestsentsvalkudega ühendatud valgud) või siis antikehade abil (fluorestsentsmärgisega antikehad, mis seostuvad rakkude pinnal paiknevate retseptoritega).[65]

Registreeritud signaalide alusel koostatakse graafik, mis näitab, kui palju teatud tunnustega objekte on proovi analüüsi käigus registreeritud. Graafiku ühel teljel on peaaegu alati objekti suurus ning teisel objekti granulaarsus; täiendava dimensioonina võib lisanduda ka fluorestsentsi intensiivsus. Sel viisil saab varasemate teadmiste najal analüüsida, milliseid objekte proov sisaldab – näiteks kasutatakse voolutsütomeetriat laialdaselt hematoloogilistes uuringutes, tegemaks kindlaks erinevate vererakkude populatsioonide olemasolu ja hulka vereproovis. Lisaks analüütilistele eesmärkidele, kasutatakse tsütomeetreid ka preparatiivsetel eesmärkidel, st püüdmaks proovist välja just teatud omadustega objekte (nt ainult fluorestseeruvaid rakke).[66][67][68]

Antikehade kasutamisel põhinevad tehnikad

[muuda | muuda lähteteksti]
IgG skemaatiline arhitektuur. V tähistab muutuvaid domeene (ingl k variable), mis igal samas organismis toodetud antikehal on erinevad, ja C konstantseid domeene (ingl k constant), mis igal samas organismis toodetud antikehal on samad. Disulfiidsidemed on näidatud kui S-S ja katkendliku ringjoonega on näidatud üks saitidest, kuhu seostub antigeen.

Antikehad on suured valgulised molekulid, mida loomade adaptiivne immuunsüsteem (ehk kohanev immuunsüsteem) toodab, tuvastamaks võõrorganismidest pärinevaid valke. Kuna antikeha ülesandeks on potentsiaalse haigustekitaja võimalikult selektiivne äratundmine, saab antikehi kasutada ka fundamentaalteaduses valkude tuvastamiseks keerulistes segudes. Kui näiteks soovitakse valmistada antikeha mõne inimorganismi valgu vastu, siis tuleb sellist antikeha toota mõne teise imetaja (nt küüliku või hiire) organismis, immuniseerides looma inimese valguga (nn antigeen).[69]

Antikehade molekulmass oleneb antikeha konkreetsest tüübist, kusjuures levinumaks on immunoglobuliin G (IgG) molekulmassiga ligi 150 kDa. IgG struktuuris saab eristada kaks põhilist funktsionaalset osa: nn Fab fragment, mis seostub selektiivselt antigeeniga, ja Fc fragment, mis tagab IgG koospüsimist. Puhastatud IgG molekulis saab Fc fragmenti seejuures üsna selektiivselt keemiliselt muundada, ühendades IgG sel viisil näiteks fluorestsentsvärvi või suurema osakese/mikrotiiterplaadi süvendi pinnaga. Sel viisil muundatud antikehi kasutatakse antigeen-valkude selektiivseks tuvastamiseks eri meetodites:[70]

  • Immunoloogiline kapillaarülekanne (ingl k Western blot) – geelelektroforeesi järel kantakse valgud elektrivälja abiga üle õhukesele membraanile ning seejärel ilmutatakse membraanil analüüsitava valgu asukoht, kasutades selektiivset antikeha. Tuvastuse õigsust on võimalik kontrollida valgu teadaoleva molekulmassi alusel. Meetod on poolkvantitatiivne, võimaldades võrrelda valgu sisaldust eri proovides.[71][72]
  • Immunoensüümmeetod (ELISA) – on teostatav eri formaatides, millest tuntuim on nn võileib-ELISA (ingl k sandwich-ELISA). Mikroplaadi süvendisse kinnitatakse antikeha, seejärel lisatakse süvendisse analüüsitav homogeenne proov. Pärast inkubeerimist ja pinnaga seostumata jäänud proovi komponentide mahapesemist lisatakse veel üks antikeha, mis seostub analüüsitava valgu teise osaga (vältimaks konkurentsi pinnaga seotud antikehaga). Meetod on kvantitatiivne, kui kasutatakse sisestandardit (st analüüsitava valgu teadaoleva kontsentratsiooniga lahus). ELISA-st on ka mitmeid modifikatsioone, sh kiirtestid, mille puhul on kvalitatiivne vastus (nt kas proovis leidub teatud viirusele omast valku) olulisem kvantitatiivsest.[73][74][75]
  • Immunohistokeemia (IHC) – proovina kasutatakse tahkeid koelõike, mida valmistatakse eluskoe parafiniseerimise või krüokülmutamise ja fikseerimise järel. Proovi eeltöötlus peab tagama valkude asukoha ja hulga säilimist, kuid seejuures blokeerima elussüsteemidele iseloomulikke protsesse (nt rakkude ainevahetus või jagunemine). Koelõigud värvitakse antikehaga, millele järgneb optiline mikroskoopia. Meetod on poolkvantitatiivne ning lubab tuvastada valgu sisaldust koes leiduvate rakkude eri populatsioonides ning valgu ligikaudset asukohta rakus (nt plasmamembraan, tsütosool või rakutuum). IHC-d kasutatakse laialdaselt patsientide koeproovide analüüsiks, tuvastamaks näiteks vähirakkude vohamise eest vastutavate valkude olemasolu.[76][77][78]
  • Immunotsütokeemia (ICC), mida nimetatakse sageli ka immunofluorestsentsiks (IF) – sarnaneb suuresti IHC-ga, kuid teostatakse rakukultuuris ettekasvatatud rakkude, mitte patsientidelt biopsia jaoks võetud koelõikudega. Meetod on poolkvantitatiivne ning lubab tuvastada valgu täpsemat asukohta rakus (eriti juhul, kui kasutatakse organellide markereid ja/või superlahutusmikroskoopia tehnikaid).[79][80][81]

Antikehi saab toota ka translatsioonijärgselt modifitseeritud valgu või sellega sarnase peptiidi suhtes, et saadud antikeha tunneks eelistatult ära just sellist valgu vormi. Kõik antikehi kasutavad meetodid eeldavad antikeha suurt selektiivsust antigeeni suhtes, kuigi reaalsuses ei ole selektiivsus absoluutne. Tänapäeval on suur osa antikehadest kommertsiaalselt kättesaadav, kusjuures antikeha valikul tuleb arvestada ka tootja soovitusi meetodi osas, sest sama antikeha ei pruugi olla kasutatav eri tüüpi rakendusteks.[82]

Proteoomikaga seotud andmebaasid

[muuda | muuda lähteteksti]
Vastastikmõjude kaart ProteomicsDB otsingu tulemustega valkude Aurora A (AURKA) ja Aurora B (AURKB) jaoks ning ravimite alisertiib, barasertiib ja barasertiib HQPA jaoks. Kollased ruudud tähistavad ravimeid, sinised ringid valke.

Valkude uurimisega seotud andmebaasid on pikemalt kirjeldatud proteoomialases artiklis. Vahetult proteoomikaga on tugevalt seotud kaks andmebaasi: ProteomicsDB ja Human Protein Atlas.

ProteomicsDB

[muuda | muuda lähteteksti]

ProteomicsDB on ühtaegu andmebaas ja repositoorium (ehk andmehoidla), kuhu on koondatud suur osa massispektromeetria abil tehtud proteoomikauuringute (publitseeritud) tulemustest. Andmebaasis on esindatud inimese, koduhiire, hariliku müürlooga ja hariliku riisi proteoomid, kusjuures inimese proteoomi katvus on 83,3% (4. detsembri 2022 seisuga). Andmebaasis on võimalik otsida proteoomika uuringutest selgunud infot konkreetsete valkude kohta (nt eri proteaaside lagundamisel tekkivate peptiidide täpne koostis ja molekulmass, aga ka valk-valk interaktsioonide kaardistamisel selgunud partnerid) ja tuntud ravimite kohta (st milliste rakusiseste protsessidega on proteoomi tasemel ravimid seotud ning millised on ravimite raporteeritud valgulised sihtmärgid). Andmebaasis sisalduvat infot on mugav alla laadida nt CSV-failidena ning mõningate andmete kohta pakutakse ka visualiseerimist pildina (nt valgu vastastikmõjude kaart või ravimi teadaolevad sihtmärgid).[83]

Human Protein Atlas (HPA)

[muuda | muuda lähteteksti]

HPA keskendub inimese transkriptoomile ja proteoomile ja selle muutustele patoloogia (eriti vähkkasvajate) kontekstis. Kuigi proteoomika andmed ei ole kättesaadavad kõigi geenide jaoks (st mõningate geenide puhul on olemas vaid info mRNA tasemel), sisaldab HPA 7. detsembri 2022 seisuga infot 17291 valgu kohta, mille uurimiseks on kasutatud 27397 antikeha ning andmebaasi täiendatakse pidevalt (suuremaid värskendusi tehakse ligi poole aastat tagant).[84]

Mõisted valk ja valgu uurimismeetod on ilmunud teaduskirjandusse enam kui sajand tagasi, kuid märksõnade kasutus kasvas hüppeliselt pärast teist maailmasõda (ilmselt seoses radioaktiivsete isotoopide kasutuselevõtuga valkude uuringuteks[85]) ning 1960. aastate teises pooles (ilmselt seoses antikehade kasutuselevõtuga valkude uuringuteks[86]). Kompleksne lähenemine valkudele kui kooslusele sai aga võimalikuks alles 1990. aastatel, kui toimus arvutite võimsuse[87] ja kõrglahutus-massispektromeetria tehnikate[88] kiire areng ning alustati ka inimgenoomi järjestamise projekti[89].

Proteoomika meetoditest on HPA-s tugevalt esindatud immunohistokeemia (st info eri valkude sisalduse ja ligikaudse rakusisese lokalisatsiooni kohta inimkudedes) ja immunotsütokeemia (st info eri valkude sisalduse ja täpse rakusisese lokalisatsiooni kohta erinevates rakuliinides). Nii IHC kui ka ICC osas esitatakse hulgaliselt mikroskoopiapilte, mille juurde on märgitud ka konkreetse kasutatud antikeha kood ja tootja. Lisaks sisaldab HPA detailsemaid alajaotusi ajus, immuunsüsteemis ja veres sisalduvate valkude kohta. Samuti saab päringu ehitada elundi-, koe- või rakutüübi järgi, kus kuvatakse süsteemi teadaolevat proteoomi ja selle sarnasust teiste elundite/kudede/rakutüüpide proteoomiga.[90]

Proteoomikaga seotud teaduspublikatsioonide statistika

[muuda | muuda lähteteksti]

Teema kokkuvõtteks on allpool esitatud statistikat teaduskirjanduse andmebaasi PubMed põhjal, näitamaks valkude uuringutega üldisemalt ning proteoomikaga konkreetsemalt seotud märksõnade kasutamise sagedust teadusartiklites eri aastatel. PubMed on USA Rahvusliku Terviseinstituudi (National Institutes of Health, NIH) hallatud avalik andmebaas, mis refereerib eelistatult meditsiini-, bioloogia- ja biokeemiauuringutega seotud teadusajakirju.[91]

Terminiotsing on tehtud 4. detsembril 2022: märksõnad protein (valk) ja protein assay (valgu uurimismeetod) said otsitud ilma jutumärkideta ning märksõnad proteome (proteoom) ja proteomics (proteoomika) koos jutumärkidega, sest muidu käsitleb PubMed kaht viimast märksõna otsingus sünonüümidena. Statistika on esitatud joonisena (tuleb tähele panna, et y-telg on logaritmilises skaalas). 2022. aasta puhul esinev süstemaatiline langustrend on seotud asjaoluga, et otsing teostati enne aasta lõppu, seega ei kajastu selle aasta statistikas kõik relevantsed teadustööd (mis võivad olla teadusajakirja avaldamiseks vastu võetud, kuid pole veel ilmunud).

Viited

[muuda | muuda lähteteksti]
  1. ↑ Jeffrey M. Perkel (20. september 2021). "Single-cell proteomics takes centre stage". Nature: Technology Feature. Vaadatud 01.12.2022.
  2. ↑ Sarah Hayton, Garth L. Maker, Ian Mullaney, Robert D. Trengove (2017). Experimental design and reporting standards for metabolomics studies of mammalian cell lines. Cellular and Molecular Life Sciences: Springer Link. Lk 4421-4441.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  3. ↑ Li Yu, Kefeng Li, Xiaoye Zhang (2017). Next-generation metabolomics in lung cancer diagnosis, treatment and precision medicine: mini review. Oncotarget. Lk 115774-115786.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  4. ↑ David S Wishart (2011). Advances in metabolite identification. Bioanalysis: Future Science.
  5. ↑ Paul R. Graves, Timothy A. J. Haystead (2002). Molecular Biologist's Guide to Proteomics. Microbiol Mol Biol Rev.: ASM Journals. Lk 39-63.
  6. ↑ EMBL-EBI (2022). "Proteomics: An introduction to EMBL-EBI resources". EMBL-EBI Training. Vaadatud 01.12.2022.
  7. ↑ Kondethimmanahalli Chandramouli, Pei-Yuan Qian (2009). Proteomics: Challenges, Techniques and Possibilities to Overcome Biological Sample Complexity. Hum Genomics Proteomics.
  8. ↑ Bilal Aslam, Madiha Basit, Muhammad Atif Nisar, Mohsin Khurshid, Muhammad Hidayat Rasool (2017). Proteomics: Technologies and Their Applications. Journal of Chromatographic Science: Oxford Academic. Lk 182–196.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  9. ↑ Erica Brunelle, Anh Minh Le, Crystal Huynh, Kelly Wingfield, Lenka Halámková, Juliana Agudelo, Jan Halámek (2017). Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye: An Application for Forensic Fingerprint Analysis. Analytical Chemistry: ACS Publications. Lk 4314-4319.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  10. ↑ Pamlea N. Brady, Megan A. Macnaughtan (2015). Evaluation of colorimetric assays for analyzing reductively methylated proteins: Biases and mechanistic insights. Analytical Biochemistry: Elsevier. Lk 43-51.
  11. ↑ Yizhang Wen, Yingtian Hu, Xiaoping Wang (2016). Application of a colorimeter for turbidity measurement. Journal of Physics: Conference Series: IOP Science.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  12. ↑ Marion M.Bradford (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry: Elsevier. Lk 248-254.
  13. ↑ Clarivate Analytics. "2 results from All Databases for: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding (Topic)". Web of Science. Vaadatud 2.12.2022.
  14. ↑ M. Prakash, J. K. Shetty, S. Dash, B. K. Barik, A. Sarkar, R. Prabhu (2008). Determination of urinary peptides in patients with proteinuria. Indian J Nephrol. Lk 150-154.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  15. ↑ Ben C. Collins, Christie L. Hunter, Yansheng Liu, Birgit Schilling, George Rosenberger, Samuel L. Bader, Daniel W. Chan, Bradford W. Gibson, Anne-Claude Gingras, Jason M. Held, Mio Hirayama-Kurogi, Guixue Hou, Christoph Krisp, Brett Larsen, Liang Lin, Siqi Liu, Mark P. Molloy, Robert L. Moritz, Sumio Ohtsuki, Ralph Schlapbach, Nathalie Selevsek, Stefani N. Thomas, Shin-Cheng Tzeng, Hui Zhang, Ruedi Aebersold (2017). Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature Communications: Nature.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  16. ↑ 16,0 16,1 Sara Kassem, Kyra van der Pan, Anniek L. de Jager, Brigitta A. E. Naber, Inge F. de Laat, Alesha Louis, Jacques J. M. van Dongen, Cristina Teodosio, Paula Díez (2021). Proteomics for Low Cell Numbers: How to Optimize the Sample Preparation Workflow for Mass Spectrometry Analysis. J. Proteome Res.: ACS Publications. Lk 4217-4230.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  17. ↑ Mary Johnson (2012). Protein Quantitation. MATER METHODS: Labome.
  18. ↑ Dr. Samanthi (19.03.2019). "Difference Between Bradford and Lowry Protein Assay". DifferenceBetween.com. Vaadatud 02.12.2022.
  19. ↑ Oliver H. Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr, Rose J. Randall (1951). Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry: Elsevier. Lk 265-275.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  20. ↑ Clarivate Analytics. "Protein measurement with the Folin phenol reagent: Citation Network". Web of Science. Vaadatud 02.12.2022.
  21. ↑ Wang, Wei-Qing; Jensen, Ole Nørregaard; Møller, Ian Max; Hebelstrup, Kim H.; Rogowska-Wrzesinska, Adelina (25. august 2018). "Evaluation of sample preparation methods for mass spectrometry-based proteomic analysis of barley leaves". Plant Methods. 14 (1): 72. DOI:10.1186/s13007-018-0341-4. ISSN 1746-4811. PMC 6109330. PMID 30159003.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link)
  22. ↑ Duong, Van-An; Lee, Hookeun (2023). "Bottom-Up Proteomics: Advancements in Sample Preparation". International Journal of Molecular Sciences (inglise). 24 (6): 5350. DOI:10.3390/ijms24065350. ISSN 1422-0067.
  23. ↑ Varnavides, Gina; Madern, Moritz; Anrather, Dorothea; Hartl, Natascha; Reiter, Wolfgang; Hartl, Markus (7. oktoober 2022). "In Search of a Universal Method: A Comparative Survey of Bottom-Up Proteomics Sample Preparation Methods". Journal of Proteome Research (inglise). 21 (10): 2397–2411. DOI:10.1021/acs.jproteome.2c00265. ISSN 1535-3893. PMC 9552232. PMID 36006919.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link)
  24. ↑ Ozlem Coskun (2016). Separation techniques: Chromatography (PDF). North Clin Istanbul: Health Directorate of Istanbul. Lk 156-160.
  25. ↑ Matthew J. Sorensen, Brady G. Anderson, Robert T. Kennedy (2020). Liquid chromatography above 20,000 PSI. TrAC Trends in Analytical Chemistry: Elsevier.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  26. ↑ Goran Mitulović (2014). New HPLC Techniques for Proteomics Analysis: A Short Overview of Latest Developments. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies: Taylor and Francis Online. Lk 390-403.
  27. ↑ Goran Mitulović, Karl Mechtler (2006). HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments. Briefings in Functional Genomics: Oxford Academic. Lk 249-260.
  28. ↑ Juraj Lenčo, Siddharth Jadeja, Denis K. Naplekov, Oleg V. Krokhin, Maria A. Khalikova, Petr Chocholouš, Jiří Urban, Ken Broeckhoven, Lucie Nováková, František Švec (2022). Reversed-Phase Liquid Chromatography of Peptides for Bottom-Up Proteomics: A Tutorial. J. Proteome Res.: ACS Publications. Lk 2846–2892.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  29. ↑ Judith Vajda, Eva Katharina Richter (2014). "Columns and Analytical Standards for Protein SEC". Analytix. Vaadatud 07.12.2022.
  30. ↑ "A Simple Strategy for Protein Enrichment Using Ultrafiltration". Sigma Aldrich. Vaadatud 07.12.2022.
  31. ↑ Eline Oeyen, Kurt Van Mol, Geert Baggerman, Hanny Willems, Kurt Boonen, Christian Rolfo, Patrick Pauwels, An Jacobs, Karin Schildermans, William C Cho, Inge Mertens (2018). Ultrafiltration and size exclusion chromatography combined with asymmetrical-flow field-flow fractionation for the isolation and characterisation of extracellular vesicles from urine. J Extracell Vesicles: Taylor and Francis Online.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  32. ↑ Rui Wei, Libo Zhao, Guanyi Kong, Xiang Liu, Shengtao Zhu, Shutian Zhang, Li Min (2020). Combination of Size-Exclusion Chromatography and Ultracentrifugation Improves the Proteomic Profiling of Plasma-Derived Small Extracellular Vesicles. Biological Procedures Online: BMC.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  33. ↑ Katrina Meyer, Matthias Selbach (2015). Quantitative affinity purification mass spectrometry: a versatile technology to study protein–protein interactions. Frontiers in Genetics: Frontiers.
  34. ↑ John LaCava, Kelly R. Molloy, Martin S. Taylor, Michal Domanski, Brian T. Chait, Michael P. Rout (2018). Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques: Future Science.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  35. ↑ R A Engh, A Girod, V Kinzel, R Huber, D Bossemeyer (1996). Crystal structures of catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase in complex with isoquinolinesulfonyl protein kinase inhibitors H7, H8, and H89. Structural implications for selectivity. JBC: The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Lk 26157–26164.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  36. ↑ John H Morris, Giselle M Knudsen, Erik Verschueren, Jeffrey R Johnson, Peter Cimermancic, Alexander L Greninger, Alexander R Pico (2014). Affinity purification–mass spectrometry and network analysis to understand protein-protein interactions. Nature Protocols: Nature. Lk 2539–2554.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  37. ↑ Rebecca E Lane, Darren Korbie, Matt Trau, Michelle M Hill (2019). Optimizing Size Exclusion Chromatography for Extracellular Vesicle Enrichment and Proteomic Analysis from Clinically Relevant Samples. Proteomics: Wiley.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  38. ↑ Peter Feist, Amanda B Hummon (2015). Proteomic Challenges: Sample Preparation Techniques for Microgram-Quantity Protein Analysis from Biological Samples. IJMS: MDPI. Lk 3537-3563.
  39. ↑ Yangyang Bian, Runsheng Zheng, Florian P. Bayer, Cassandra Wong, Yun-Chien Chang, Chen Meng, Daniel P. Zolg, Maria Reinecke, Jana Zecha, Svenja Wiechmann, Stephanie Heinzlmeir, Johannes Scherr, Bernhard Hemmer, Mike Baynham, Anne-Claude Gingras, Oleksandr Boychenko, Bernhard Kuster (2020). Robust, reproducible and quantitative analysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nature Communications: Nature.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  40. ↑ Brianna Kim, Robyn Araujo, Marissa Howard, Ruben Magni, Lance Liotta, Alessandra Luchini (2018). Affinity Enrichment for MS: Improving the yield of low abundance biomarkers. Expert Rev Proteomics: Taylor and Francis Online. Lk 353-366.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  41. ↑ David L. Nelson, Michael M. Cox (2013). Lehninger Principles of Biochemistry (6th edition). New York: W. H. Freeman and Company. Lk 92-96.
  42. ↑ Jasmine Briones (16.08.2020). "Electrolytic Cells". LibreTexts: Chemistry. Vaadatud 08.12.2022.
  43. ↑ Creative Proteomics (2022). "1D SDS-PAGE, IEF Service". Vaadatud 08.12.2022.
  44. ↑ Christine Blancher, Adam Jones (2001). SDS-PAGE and Western Blotting Techniques. Metastasis Research Protocols: Springer Link. Lk 145-162.
  45. ↑ Lindsay A.L. Bazydlo, James P. Landers (2018). Electrophoresis. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics: Elsevier. Lk 250-265.
  46. ↑ Ian Hunt. "Chapter 27: Amino Acids, Peptides and Proteins". University of Calgary. Vaadatud 08.12.2022.
  47. ↑ Sameh Magdeldin, Shymaa Enany, Yutaka Yoshida, Bo Xu, Ying Zhang, Zam Zureena, Ilambarthi Lokamani, Eishin Yaoita, Tadashi Yamamoto (2014). Basics and recent advances of two dimensional- polyacrylamide gel electrophoresis. Clinical Proteomics: BMC.{{raamatuviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  48. ↑ Jonathan S. Minden (2012). Chapter 6 - Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis (2D DIGE). Methods in Cell Biology: Elsevier. Lk 111-141.
  49. ↑ Jonathan Minden (2018). Comparative Proteomics and Difference Gel Electrophoresis. BioTechniques: Future Science.
  50. ↑ Cañas, Benito; López-Ferrer, Daniel; Ramos-Fernández, Antonio; Camafeita, Emilio; Calvo, Enrique (2006). "Mass spectrometry technologies for proteomics". Briefings in Functional Genomics & Proteomics. 4 (4): 295–320. DOI:10.1093/bfgp/eli002. ISSN 1473-9550. PMID 17202122.
  51. ↑ Peets, Pilleriin (2016). "Metoodika arendus tekstiilivärvide uurimiseks looduslike punaste värvainete näitel" (PDF). Tartu Ülikool. Vaadatud 30.08.2023.
  52. ↑ 52,0 52,1 Saare, Margot (2015). "Varieeruvus, võimsus ja kvaliteet kvantitatiivses proteoomikas" (PDF). Tartu Ülikool. Vaadatud 30.08.2023.
  53. ↑ Printsmann, Gunnar (2017). "Eesti põhjavee analüüsimine tundmatute ja kahtlusaluste ühendite meetodil" (PDF). Tartu Ülikool. Vaadatud 30.08.2023.
  54. ↑ "26.6 Peptide Sequencing: The Edman Degradation". Chemistry LibreTexts (inglise). 25. august 2017. Vaadatud 30. augustil 2023.
  55. ↑ Shuken, Steven R. (7. juuli 2023). "An Introduction to Mass Spectrometry-Based Proteomics". Journal of Proteome Research (inglise). 22 (7): 2151–2171. DOI:10.1021/acs.jproteome.2c00838. ISSN 1535-3893.
  56. ↑ Gawor, Andrzej; Bulska, Ewa (2023). "A Standardized Protocol for Assuring the Validity of Proteomics Results from Liquid Chromatography–High-Resolution Mass Spectrometry". International Journal of Molecular Sciences (inglise). 24 (7): 6129. DOI:10.3390/ijms24076129. ISSN 1422-0067.
  57. ↑ Sinha, Ankit; Mann, Matthias (2020). "A beginner's guide to mass spectrometry–based proteomics" (PDF). Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL). Vaadatud 30.08.2023.
  58. ↑ Zhao, Yingming; Jensen, Ole N. (2009). "Modification-specific proteomics: Strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques". PROTEOMICS (inglise). 9 (20): 4632–4641. DOI:10.1002/pmic.200900398. PMC 2892724. PMID 19743430.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link)
  59. ↑ Lee, Pey Yee; Yeoh, Yeelon; Low, Teck Yew (2023). "A recent update on small-molecule kinase inhibitors for targeted cancer therapy and their therapeutic insights from mass spectrometry-based proteomic analysis". The FEBS journal. 290 (11): 2845–2864. DOI:10.1111/febs.16442. ISSN 1742-4658. PMID 35313089.
  60. ↑ Beller, Nicole C.; Hummon, Amanda B. (15. august 2022). "Advances in stable isotope labeling: dynamic labeling for spatial and temporal proteomic analysis". Molecular Omics. 18 (7): 579–590. DOI:10.1039/d2mo00077f. ISSN 2515-4184. PMC 9378559. PMID 35723214.
  61. ↑ Végvári, Ákos; Rodriguez, Jimmy E.; Zubarev, Roman A. (5. juuli 2022). "Single-Cell Chemical Proteomics (SCCP) Interrogates the Timing and Heterogeneity of Cancer Cell Commitment to Death". Analytical Chemistry (inglise). 94 (26): 9261–9269. DOI:10.1021/acs.analchem.2c00413. ISSN 0003-2700. PMC 9260713. PMID 35731985.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link)
  62. ↑ TÜ molekulaar- ja rakubioloogia instituut. "Rakubioloogia meetodid". cellbio.ebc.ee. Vaadatud 29. augustil 2023.
  63. ↑ "Sample Preparation | USF Health". health.usf.edu. Vaadatud 29. augustil 2023.
  64. ↑ "Practical Flow Cytometry". apps.beckman.com. Originaali arhiivikoopia seisuga 29. august 2023. Vaadatud 29. augustil 2023.
  65. ↑ McKinnon, Katherine M. (2018). "Flow Cytometry: An Overview". Current Protocols in Immunology (inglise). 120 (1). DOI:10.1002/cpim.40. ISSN 1934-3671. PMC 5939936. PMID 29512141.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link)
  66. ↑ Virgo, Paul F; Gibbs, Graham J (2012). "Flow cytometry in clinical pathology". Annals of Clinical Biochemistry: International Journal of Laboratory Medicine (inglise). 49 (1): 17–28. DOI:10.1258/acb.2011.011128. ISSN 0004-5632.
  67. ↑ Jaye, David L.; Bray, Robert A.; Gebel, Howard M.; Harris, Wayne A. C.; Waller, Edmund K. (15. mai 2012). "Translational applications of flow cytometry in clinical practice". Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 188 (10): 4715–4719. DOI:10.4049/jimmunol.1290017. ISSN 1550-6606. PMID 22556132.
  68. ↑ Brown, M.; Wittwer, C. (2000). "Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology". Clinical Chemistry. 46 (8 Pt 2): 1221–1229. ISSN 0009-9147. PMID 10926916.
  69. ↑ Lipman, Neil S.; Jackson, Lynn R.; Trudel, Laura J.; Weis-Garcia, Frances (2005). "Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources". ILAR journal. 46 (3): 258–268. DOI:10.1093/ilar.46.3.258. ISSN 1084-2020. PMID 15953833.
  70. ↑ Charles A Janeway, Jr; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark J. (2001), "The structure of a typical antibody molecule", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition (inglise), Garland Science, vaadatud 30. augustil 2023
  71. ↑ "Learn: western blot - The Human Protein Atlas". www.proteinatlas.org. Vaadatud 30. augustil 2023.
  72. ↑ "Western Blot". www.biolegend.com (Ameerika inglise). Vaadatud 30. augustil 2023.
  73. ↑ "Learn: elisa - The Human Protein Atlas". www.proteinatlas.org. Vaadatud 30. augustil 2023.
  74. ↑ Powers, Alicia D.; Palecek, Sean P. (2012). "Protein Analytical Assays for Diagnosing, Monitoring, and Choosing Treatment for Cancer Patients". Journal of Healthcare Engineering (inglise). 3: 503–534. DOI:10.1260/2040-2295.3.4.503. ISSN 2040-2295.
  75. ↑ Hsiao, Wesley Wei-Wen; Le, Trong-Nghia; Pham, Dinh Minh; Ko, Hui-Hsin; Chang, Huan-Cheng; Lee, Cheng-Chung; Sharma, Neha; Lee, Cheng-Kang; Chiang, Wei-Hung (2021). "Recent Advances in Novel Lateral Flow Technologies for Detection of COVID-19". Biosensors (inglise). 11 (9): 295. DOI:10.3390/bios11090295. ISSN 2079-6374.
  76. ↑ "Learn: immunohistochemistry - The Human Protein Atlas". www.proteinatlas.org. Vaadatud 30. augustil 2023.
  77. ↑ "An Intro to Specimen Preparation for Histopathology". www.leicabiosystems.com. Vaadatud 30. augustil 2023.
  78. ↑ Hofman, Véronique; Lassalle, Sandra; Bence, Coraline; Long-Mira, Elodie; Nahon-Estève, Sacha; Heeke, Simon; Lespinet-Fabre, Virginie; Butori, Catherine; Ilié, Marius; Hofman, Paul (2018). "Any Place for Immunohistochemistry within the Predictive Biomarkers of Treatment in Lung Cancer Patients?". Cancers (inglise). 10 (3): 70. DOI:10.3390/cancers10030070. ISSN 2072-6694.
  79. ↑ "Learn: immunocytochemistry - The Human Protein Atlas". www.proteinatlas.org. Vaadatud 30. augustil 2023.
  80. ↑ Sanderson, Michael J.; Smith, Ian; Parker, Ian; Bootman, Martin D. (1. oktoober 2014). "Fluorescence microscopy". Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10): pdb.top071795. DOI:10.1101/pdb.top071795. ISSN 1559-6095. PMC 4711767. PMID 25275114.
  81. ↑ Lubenets, Dmitri; Maimets, Toivo; Kuuse, Sulev (2021). "Superlahutusmikroskoopia: vaatleme detaile raku sees" (PDF). Eesti Loodus (680) – cit. via tymri.ut.ee.
  82. ↑ Saper, Clifford B. (2009). "A Guide to the Perplexed on the Specificity of Antibodies". Journal of Histochemistry & Cytochemistry (inglise). 57 (1): 1–5. DOI:10.1369/jhc.2008.952770. ISSN 0022-1554. PMC 2605712. PMID 18854594.{{ajakirjaviide}}: CS1 hooldus: PMC vormistus (link)
  83. ↑ Technische Universität München. "Welcome to ProteomicsDB". Vaadatud 4.12.2022.
  84. ↑ KI, KTH, UU, SciLifeLab. "The Human Protein Atlas: Release history". The Human Protein Atlas. Vaadatud 7.12.2022.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  85. ↑ Daniel James Wilkinson (2018). Historical and contemporary stable isotope tracer approaches to studying mammalian protein metabolism. Mass Spectrom Rev: Wiley Analytical Science. Lk 57-80.[alaline kõdulink]
  86. ↑ Suleyman Aydin (2015). A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides: Elsevier. Lk 4-15.
  87. ↑ Nick Routley (4. november 2017). "Visualizing the Trillion-Fold Increase in Computing Power". Visual Capitalist. Vaadatud 4.12.2022.
  88. ↑ Jennifer Griffiths (2008). A Brief History of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry: ACS Publications. Lk 5678–5683.
  89. ↑ National Human Genome Research Institute. "The Human Genome Project". National Institutes of Health. Vaadatud 4.12.2022.
  90. ↑ KI, KTH, UU, SciLifeLab (31.05.2022). "The Human Protein Atlas". Vaadatud 4.12.2022.{{netiviide}}: CS1 hooldus: mitu nime: autorite loend (link)
  91. ↑ National Center for Biotechnology Information. "PubMed". National Library of Medicine. Vaadatud 4.12.2022.
Pärit leheküljelt "https://et.wikipedia.org/w/index.php?title=Proteoomika&oldid=6549391"