Nitrogenase
Nitrogenase | |||||||
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Representação estrutural de um dímero da proteína contendo o cofactor de ferro-molibdénio da nitrogenase de Azotobacter vinelandii. PDB 1FP4 | |||||||
Indicadores | |||||||
Número EC | 1.18.6.1 | ||||||
Número CAS | 9013-04-1-- | ||||||
Bases de dados | |||||||
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ExPASy | NiceZyme | ||||||
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MetaCyc | via metabólica | ||||||
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Estruturas PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum | ||||||
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Nitrogenase (fladodoxina) | |||||||
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Indicadores | |||||||
Número EC | 1.19.6.1 | ||||||
Bases de dados | |||||||
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ExPASy | NiceZyme | ||||||
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MetaCyc | via metabólica | ||||||
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Estruturas PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum | ||||||
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A nitrogenase é uma enzima que reduz azoto molecular (N2) a amónia (NH3). Esta conversão é a principal etapa na fixação de azoto atmosférico, levada a cabo por organismos diazotróficos.
A enzima é um complexo composto por duas proteínas: a dinitrogénio redutase, uma proteína de ferro-enxofre contendo centros de ferro-enxofre (FeS) do tipo [4Fe-4S], e a (di)nitrogenase propriamente dita, cujo sítio activo é composto por um centro de ferro-molibdénio (FeMoco).
Existem duas classes de nitrogenases, classificadas de acordo com o seu dador de electrões: nitrogenases dependentes de proteínas de ferro-enxofre (usualmente a ferredoxina ou a rubredoxina; EC 1.18.6.1) e nitrogenases dependentes de flavodoxinas (EC 1.19.6.1). A dinitrogénio redutase, após activação pelo ATP, recebe os electrões destes dadores, transferindo-os de seguida para o centro FeMo via um centro [8Fe-7S] (centro P). O centro FeMo pode então efectuar a catálise. Os centros P e FeMo são encontrados em exclusivo nas nitrogenases.
Estrutura do complexo enzimático
[editar | editar código-fonte]A nitrogenase é na realidade um complexo de duas proteínas que não se encontram permanentemente ligadas entre si[1]:
- A nitrogenase propriamente dita, também denominada proteína de ferro-molibdénio (FeMo) ou componente I. Catalisa a redução do N2.
- A dinitrogénio redutase, também denominada proteína de ferro ou componente II. Transfere electrões de um dador electrónico para a proteína de ferro-molibdénio.
A enzima é activa somente quando as duas componentes se encontram associadas. É extremamente sensível ao dioxigénio (O2), sendo rapidamente inactivada em condições aeróbias.[2]
A proteína de ferro-molibdénio
[editar | editar código-fonte]A proteína de ferro-molibdénio (nitrogenase propriamente dita ou componente I; abreviada proteína FeMo ou MoFe) é uma proteína tetramérica do tipo
O cofactor FeMo tem uma geometria similar a dois centros [4Fe-4S] fundidos num vértice, com outro vértice mais exterior sendo o átomo de molibdénio. Este liga, por sua vez, uma molécula de R-homocitrato. O átomo central X é, baseado na estrutura cristalográfica de maior resolução existente, carbono, oxigénio ou azoto, tendo sido sugerido o azoto com melhor candidato,[4] embora outros estudos não tenham conseguido confirmar esta hipótese.[1]
A geometria do centro P é também semelhante à de dois centros [4Fe-4S] fundidos num vértice, partilhando neste caso um sulfureto. Aquando da ligação entre as duas proteínas, o centro P situa-se entre o centro de ferro-enxofre da dinitrogénio redutase e o centro FeMo. Esta evidência estrutural, junto com outros estudos, utilizando técnicas de cinética rápida acopladas a espectroscopia EPR e mutagénese dirigida, sugere um papel activo do centro P na transferência electrónica entre as duas componentes.[1] Quando oxidado, o centro P sofre uma alteração conformacional induzida pela dissociação de dois aminoácidos ligandos, mas é desconhecida a importância da existência desta alteração.[1]
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Teoricamente, o centro P é capaz de sofrer oxirredução multielectrónica, mas desconhece-se se o centro transfere apenas um electrão de cada vez ou se oscila entre maiores estados de oxidação, comportando-se como um condensador eléctrico.[5]
Embora esta proteína possa ser reduzida por outros agentes redutores que não a dinitrogénio redutase, não consegue catalisar o N2 na ausência desta, inferindo a existência de uma alteração conformacional induzida pela ligação das duas proteínas, dependente da hidrólise de ATP.[1]
A proteína de ferro
[editar | editar código-fonte]A proteína de ferro (dinitrogénio redutase ou componente II) é um homodímero, com uma massa molecular total por volta dos 60 000 Da, que liga covalentemente um centro de ferro-enxofre (do tipo [4Fe-4S]) e possui locais de ligação para o ATP ou ADP.[2] O gene que codifica esta proteína é designado nifH.[3] A redutase interage com a proteína de ferro-molibdénio (uma molécula de redutase por cada dímero
O centro FeS desta proteína é extremamente sensível à presença de oxigénio e perde dois átomos de ferro em condições aeróbias.[5]
Mecanismo catalítico
[editar | editar código-fonte]A redução do azoto molecular é a principal reacção do ciclo biogeoquímico do azoto[6]. Na conversão de N2 a NH3, a ligação tripla do azoto tem de ser (pelo menos parcialmente) quebrada, sendo este processo energeticamente custoso. Na ausência de um catalisador biológico, a reacção requer alta pressão e temperatura, no denominado processo de Haber-Bosch; a nitrogenase consegue efectuar a mesma reacção em condições biológicas (pressão atmosférica, temperatura ambiente), requerindo no entanto seis electrões e ATP:
- 8 e- + 8 H+ + N2 + 16 ATP + 16 H2O = 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi
Durante a reacção, a dinitrogénio redutase recebe um electrão do dador electrónico, transferindo-o para o centro FeMo, que por sua vez o adiciona à molécula de azoto; as duas proteínas dissociam-se de modo a possibilitar uma nova transferência electrónica para a redutase, que volta então a associar-se à proteína FeMo e transfere o novo electrão para o centro FeMo. Este sequência repete-se as vezes necessárias para que seja totalmente efectuada a redução do N2 a NH3 e eventualmente a produção de H2.[6]
Os locais específicos de ligação do substrato e dos intermediários reaccionais ao cofactor FeMo não estão totalmente esclarecidos, assim como não é conhecido em pormenor o mecanismo da reacção.[6][7] Apesar disto, existem estudos em mutantes da proteína FeMo que apontam para a existência da ligação a uma face específica do cofactor[1] e diversos estudos espectroscópicos identificaram alguns dos intermediários reaccionais, nomeadamente o diazeno (N2H2) e a hidrazina (N2H4).[6][1]
É geralmente aceite o seguinte modelo geral para o mecanismo catalítico[1]:
- o ATP liga-se à proteína de ferro, induzindo uma alteração na sua conformação estrutural;
- a proteína de ferro, mais especificamente o seu centro [4Fe-4S]2+, recebe um electrão do dador electrónico (por exemplo, ferredoxina), convertendo-se na forma reduzida [4Fe-4S]+;
- a proteína de ferro associa-se à proteína FeMo, ocorrendo hidrólise simultânea do ATP a ADP e transferência do electrão do centro [4Fe-4S] para o centro P da proteína FeMo;
- ocorre dissociação das duas proteínas e libertação de ADP por parte da proteína de ferro; a proteína FeMo utiliza o electrão recebido num dos passos catalíticos de redução do N2. O centro FeMo tem de receber 3 ou 4 electrões antes de poder ligar o N2.
![](https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/29/Nitrogenase_general_catalytic_scheme.svg/800px-Nitrogenase_general_catalytic_scheme.svg.png)
Mecanismo proposto
[editar | editar código-fonte]![](https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/60/FeMoco_cluster.svg/220px-FeMoco_cluster.svg.png)
Embora o mecanismo da redução do gás nitrogênio pelo cofator FeMoco ainda não seja totalmente esclarecido, há estudos e evidências que apontam para um mecanismo provável. [8][9] Nesse mecanismo proposto, o FeMoco existe em nove estados possíveis:
- E0 - o estado original, como mostrado na imagem acima.
- E1 - o cofator recebe um íon H+ e 1 elétron; um dos íons Fe3+ é reduzido para Fe2+. O hidrogênio recebido fica ligado a um dos enxofres equatoriais da estrutura (aqueles na altura do carbono central), que fica na forma de um grupo sulfidrila (-SH) entre dois átomos de ferro.
- E2 - o cofator recebe mais um próton e mais um elétron. Esse H+ combina com o elétron e depois oxida o Fe2+ de volta a Fe3+, ficando na forma de um equivalente de hidreto (H–) ligado entre dois ferros (formando, assim, uma ligação tricentrada Fe--H--Fe).
- E3 - o cofator recebe mais um elétron e íon hidrogênio. Outro ferro +3 é reduzido a +2 e o hidrogênio se liga a outro enxofre equatorial do cluster (semelhante ao estado E1).
- E4 - Semelhante ao estado E2, outro par H+/e- é recebido. O hidrogênio se liga novamente entre dois ferros como um equivalente de hidreto, com o ferro reduzido na reação anterior sendo novamente oxidado, formando uma ponte [FeIII--H--FeII--H--FeIII] (com o ferro central divalente localizado próximo ao molibdênio). É nesta etapa que o gás nitrogênio se liga ao cofator, deslocando os dois hidretos ligados aos ferros como gás H
2 e deixando o átomo de ferro central reduzido ao estado de oxidação zero. É nesse suposto ferro zerovalente, localizado próximo ao átomo de molibdênio, que o N
2 permanece ligado, sob a forma de um complexo backbonding de dinitrogênio. O complexo [Fe0N≡N], então, altera-se para [Fe2+N-=N-] (com a mudança da ligação tripla do dinitrogênio para uma ligação dupla e consequente enfraquecimento dessa ligação) e abstrai os hidrogênios dos grupos -SH vizinhos para formar um equivalente de diazeno [FeNH=NH].
![](https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c7/FeMoco_E4.jpg/428px-FeMoco_E4.jpg)
- E5 - mais um par H+/e- é recebido pelo cofator, ligando-se como hidreto aos ferros, mas rapidamente reduzindo o equivalente diazeno [Fe2+NH=NH] para um equivalente hidrazinil, [Fe3+–NH–NH
2] - E6 - mais um par próton-elétron é recebido, com formação transitória de hidreto, que reduz o equivalente de hidrazinil [Fe3+–NH–NH
2] a um equivalente de hidrazina, [Fe2+NH
2–NH
2]. - E7 - mais um par próton-elétron é recebido, com formação transitória de hidreto, que reduz o equivalente de hidrazina [Fe2+NH
2–NH
2] para um derivado amideto [Fe3+–NH
2] com liberação de uma molécula de amônia (NH
3). - E8 - o último par elétron-próton é recebido, reduzindo o equivalentede amideto [Fe3+–NH
2] para um equivalente amino [Fe2+NH
3], que rapidamente se decompõe liberando uma segunda molécula de amônia, retornando o cofator de volta ao estado E0 reiniciando o ciclo. O gás nitrogênio é, assim, completamente reduzido para amônia.
Outros substratos e inibidores
[editar | editar código-fonte]A nitrogenase tem também a capacidade de reduzir acetileno a etileno, actividade esta aproveitada para a detecção da actividade enzimática; nalguns casos, o etileno pode ser reduzido a etano.[5]
O óxido nítrico (NO) é um inibidor desta enzima, ligando-se ao centro FeS da proteína de ferro e possivelmente ao cofactor FeMo.[5] Outros compostos azotados capazes de se ligarem ao centro FeMo incluem o óxido nitroso (N2O) e o nitrito (NO2-), agindo ora como substratos ora como inibidores competitivos.[5]
Outros compostos agem simultaneamente como substratos e inibidores reversíveis. Por exemplo, o ácido cianídrico (HCN) é reduzido pela nitrogenase a metano (CH4), amoníaco (NH3), metilamina (CH3NH2) e di-hidrogénio (H2), dependendo das condições utilizadas no ensaio enzimático; por outro lado, a sua base conjugada cianeto (CN-) é capaz de inibir a enzima ao desacoplar a desfosforilação do ATP e o fluxo de electrões.[10] O monóxido de carbono (CO) e a azida (N3-) competem com o CN- pelo local de ligação à enzima.[10]
Síntese in vivo
[editar | editar código-fonte]Diversas proteínas participam no enovelamento das proteínas componentes da nitrogenase, na síntese dos centros metálicos e na sua inserção nas respectivas apoproteínas.[3] A proteína NifB recebe ferro e sulfureto, mobilizados pelas proteínas NifU e NifS, e inicia a construção do cofactor FeMo, que sofre posterior maturação e inserção na nitrogenase catalisadas pelo complexo NifEN. Outras proteínas necessárias para a síntese do cofactor FeMo são a homocitrato sintase (NifV) e a NifQ, que mobiliza molibdénio. Também a dinitrogénio redutase participa na maturação da proteína FeMo, em particular na inserção do centro P, acção esta possivelmente coordenada com ainda outra proteína, NifZ.[3]
Referências
- ↑ a b c d e f g h i j k Seefeldt, L.C.; Hoffman, B.M., Dean, D.R. (2009). «Mechanism of Mo-Dependent Nitrogenase». Annu Rev Biochem (em inglês). 78. pp. 701–22. ISSN 0066-4154. doi:10.1146/annurev.biochem.78.070907.103812. Consultado em 12 de setembro de 2011
- ↑ a b c d Georgiadis, M.M.; Komiya, H., Chakrabarti, P., Woo, D., Kornuc, J. J., Rees, D. C. (1992). «Crystallographic Structure of the Nitrogenase Iron Protein from Azotobacter vinelandii». Science (em inglês). 257. AAAS. pp. 1653–59. ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1529353. Consultado em 12 de setembro de 2011
- ↑ a b c d Hu, Y.; Fay, A.W., Lee, C.C., Yoshizawa, J., Ribbe, M.W. (2008). «Assembly of Nitrogenase MoFe Protein». Biochemistry (em inglês). 47. ACS Publications. pp. 3973–3981. ISSN 1520-4995. doi:10.1021/bi7025003. Consultado em 17 de setembro de 2011
- ↑ Einsle, O.; Tezcan, F.A., Andrade, S.L.A., Schmid, B. Yoshida, M., Howard, J.B., Rees, D.C. (2002). «Nitrogenase MoFe-Protein at 1.16 Å Resolution: A Central Ligand in the FeMo-Cofactor». Science (em inglês). 297. AAAS. pp. 1696–1700. ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1073877. Consultado em 14 de setembro de 2011
- ↑ a b c d e f g Burgess, B.K.; Lowe, D.J. (1996). «Mechanism of Molybdenum Nitrogenase». Chem. Rev. (em inglês). 96. ACS Publications. pp. 2983–3012. ISSN 1520-6890. doi:10.1021/cr950055x. Consultado em 15 de setembro de 2011
- ↑ a b c d Barney, B.M.; Lee, H.-I., dos Santos, P.C., Hoffman, B.M., Dean, D.R., Seefeldt, L.C. (2006). «Breaking the N2 triple bond: insights into the nitrogenase mechanism». Dalton Trans. (em inglês). 19. RSC Publishing. pp. 2277–84. ISSN 1364-5447. doi:10.1039/B517633F. Consultado em 12 de setembro de 2011
- ↑ dos Santos, P.C.; Igarashi, R.Y., Lee, H.-I., Hoffman, B.M., Seefeldt, L.C., Dean, D.R. (2005). «Substrate Interactions with the Nitrogenase Active Site». Acc. Chem. Res. (em inglês). 38. ACS Publications. pp. 208–14. ISSN 1520-4898. doi:10.1021/ar040050z. Consultado em 12 de setembro de 2011
- ↑ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2840065/
- ↑ https://www.nature.com/articles/ncomms10902
- ↑ a b Li, J.; Burgess, B.K., Corbin, J.L. (1982). «Nitrogenase reactivity: cyanide as substrate and inhibitor». Biochemistry (em inglês). 21. ACS Publications. pp. 4393–4402. ISSN 1520-4995. doi:10.1021/bi00261a031. Consultado em 17 de setembro de 2011