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免疫 めんえき 染色 せんしょく (Immunostaining)とは抗体 こうたい を用 もち いて、組織 そしき 標本 ひょうほん 中 ちゅう の抗原 こうげん を検出 けんしゅつ する組織 そしき 学 がく (組織 そしき 化学 かがく )的 てき 手法 しゅほう のこと。正確 せいかく には免疫 めんえき 組織 そしき 化学 かがく (Immunohistochemistry; IHC)と言 い い、「染色 せんしょく 」とは異 こと なるが、本来 ほんらい 不可視 ふかし である抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう (免疫 めんえき 反応 はんのう )を可視 かし 化 か するために発色 はっしょく 操作 そうさ を行 おこな うことから、俗 ぞく に「免疫 めんえき 染色 せんしょく 」とか「抗体 こうたい 染色 せんしょく 」と呼 よ ばれることも多 おお く、医療 いりょう 従事 じゅうじ 者 しゃ ・医学 いがく 研究 けんきゅう 者 しゃ ・生命 せいめい 科学 かがく 研究 けんきゅう 者 しゃ の「業界 ぎょうかい 用語 ようご 」的 てき な呼 よ び方 かた では、しばしば免 めん 染 しみ と略 りゃく される。なお、保険 ほけん 診療 しんりょう に用 もち いる場合 ばあい 、診療 しんりょう 報酬 ほうしゅう 上 じょう は「免疫 めんえき 抗体 こうたい 法 ほう 」とされている。
抗体 こうたい の特異 とくい 性 せい を利用 りよう して組織 そしき を“染 そ め”わけ、抗原 こうげん の存在 そんざい および局在 きょくざい を顕微鏡 けんびきょう 下 した で観察 かんさつ できるので、特定 とくてい 遺伝子 いでんし の発現 はつげん 確認 かくにん や、各種 かくしゅ のいわゆる「マーカー タンパク質 たんぱくしつ 」を用 もち いることで病理 びょうり 組織 そしき の診断 しんだん にもよく使 つか われている。また電気 でんき 泳 およげ 動 どう したタンパク質 たんぱくしつ 分子 ぶんし を特殊 とくしゅ な膜 まく に転移 てんい させ、その膜 まく を特定 とくてい タンパク質 たんぱくしつ に対 たい する抗体 こうたい で免疫 めんえき 染色 せんしょく する方法 ほうほう がウェスタンブロッティング である。"染色 せんしょく "には抗体 こうたい に色素 しきそ や蛍光 けいこう 色素 しきそ を結合 けつごう させる方法 ほうほう の他 ほか 、金 きむ コロイド を用 もち いたり、酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう を用 もち いたりする。直接 ちょくせつ 法 ほう と間接 かんせつ 法 ほう があり間接 かんせつ 法 ほう の方 ほう が一般 いっぱん に検出 けんしゅつ 感度 かんど が高 たか い。
この方法 ほうほう は基本 きほん 的 てき には抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう (免疫 めんえき 反応 はんのう )と可視 かし 化 か の2つのプロセスよりなっている。具体 ぐたい 的 てき には、組織 そしき 標本 ひょうほん 中 ちゅう の抗原 こうげん (または抗体 こうたい )に対 たい して抗体 こうたい (または抗原 こうげん )を含 ふく む液 えき を一定 いってい 時間 じかん 反応 はんのう させることによって抗原 こうげん と抗体 こうたい を結合 けつごう させて免疫 めんえき 複 ふく 合体 がったい を形成 けいせい させる。その際 さい 、反応 はんのう させる抗体 こうたい などに前 まえ もって可視 かし 化 か できるように細工 ざいく をしておく必要 ひつよう がある。
抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう を可視 かし 化 か する方法 ほうほう としては以下 いか のような方法 ほうほう がある。
オートラジオグラフィー (英 えい en:autoradiography ) 抗体 こうたい に放射 ほうしゃ 性 せい 同位 どうい 元素 げんそ を結合 けつごう (「標識 ひょうしき 」という)しておき、後 あと で印画 いんが 紙 し に感光 かんこう させる。
金 きむ コロイド法 ほう (英 えい colloidal gold technique) 金 きむ 粒子 りゅうし など可視 かし 物質 ぶっしつ に抗体 こうたい を結合 けつごう させておき、電子 でんし 顕微鏡 けんびきょう などで観察 かんさつ する。金 きむ コロイド銀 ぎん 増 ぞう 感 かん 法 ほう というより感度 かんど の高 たか い方法 ほうほう がある。これは金 きむ 粒子 りゅうし に金属 きんぞく 銀 ぎん を付着 ふちゃく させていくものである。
蛍光 けいこう 抗体 こうたい 法 ほう (英 えい immunofluorescence, IF; fluorescence antibody technique)抗体 こうたい に蛍光 けいこう 色素 しきそ を標識 ひょうしき しておき、抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう の後 のち で励起 れいき 波長 はちょう を当 あ てて蛍光 けいこう 発色 はっしょく させ蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう で観察 かんさつ する。
酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう (英 えい enzyme antibody technique)抗体 こうたい に特定 とくてい の酵素 こうそ を標識 ひょうしき しておき、後 あと で基質 きしつ を反応 はんのう させて形成 けいせい された色素 しきそ 生成 せいせい 物 ぶつ の呈 てい 色 しょく を光学 こうがく 顕微鏡 けんびきょう で観察 かんさつ する。免疫 めんえき ペルオキシダーゼ法 ほう (immunoperoxidase method)など。
※このうち、(1)(2)については常識 じょうしき 的 てき な意味 いみ での「色 いろ 」はないので「免疫 めんえき 染色 せんしょく 」とは呼 よ ばれない。また(1)〜(3)については可視 かし 化 か 操作 そうさ そのものに有機 ゆうき 化学 かがく 反応 はんのう は用 もち いていないので「化学 かがく 」と呼 よ ぶには違和感 いわかん がある。「免疫 めんえき 組織 そしき 化学 かがく 」という名称 めいしょう が広 ひろ く使 つか われ出 だ したのはおよそ20年 ねん 前 まえ に(4)の酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう が考案 こうあん されてからである。もともと有機 ゆうき 化学 かがく 反応 はんのう を用 もち いて組織 そしき 標本 ひょうほん 中 ちゅう の酵素 こうそ を検出 けんしゅつ する方法 ほうほう として「組織 そしき 化学 かがく histochemistry 」という名称 めいしょう が使用 しよう されていたこともあって、それに「免疫 めんえき 」を組 く み合 あ わせたわけである。従 したが って、「免疫 めんえき 組織 そしき 化学 かがく 」とは狭義 きょうぎ には「酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう 」を指 さ すものと理解 りかい すべきであろう。
抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう に関 かん しても大 おお きく分 わ けて以下 いか の2種類 しゅるい の方法 ほうほう がある。
直接 ちょくせつ 法 ほう 抗原 こうげん に直接 ちょくせつ 反応 はんのう する抗体 こうたい (一 いち 次 じ 抗体 こうたい )を標識 ひょうしき し、抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう を1度 ど しか行 おこな わない
間接 かんせつ 法 ほう 標識 ひょうしき していない一 いち 次 じ 抗体 こうたい を用 もち いて1度目 どめ の抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう を行 おこな い、一 いち 次 じ 抗体 こうたい 自体 じたい を抗原 こうげん とする別 べつ の抗体 こうたい (二 に 次 じ 抗体 こうたい )を標識 ひょうしき して、さらに反応 はんのう させて2回 かい 以上 いじょう (多 おお くは2回 かい )抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう を行 おこな う
※検出 けんしゅつ 目的 もくてき である抗原 こうげん に直接 ちょくせつ 反応 はんのう する抗体 こうたい を標識 ひょうしき して可視 かし 化 か する場合 ばあい が直接 ちょくせつ 法 ほう 、それ以外 いがい の抗体 こうたい などに標識 ひょうしき して可視 かし 化 か (つまり間接 かんせつ 的 てき に可視 かし 化 か )する場合 ばあい が間接 かんせつ 法 ほう となる。抗体 こうたい は免疫 めんえき グロブリン という蛋白 たんぱく であり、それ自体 じたい が抗原 こうげん となり得 え るので、理屈 りくつ 上 じょう 、間接 かんせつ 法 ほう では抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう を3度 ど でも4度 ど でも反復 はんぷく することができる。一般 いっぱん に反応 はんのう は反復 はんぷく するほど増幅 ぞうふく されるので検出 けんしゅつ 感度 かんど を高 たか めることができるが、同時 どうじ に特異 とくい 性 せい は低下 ていか する。
酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう (間接 かんせつ 法 ほう )の種別 しゅべつ [ 編集 へんしゅう ]
その他 た に、酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう での間接 かんせつ 法 ほう のバリエーションとも言 い うべきものとして以下 いか の方法 ほうほう があり、特 とく に一般 いっぱん 病院 びょういん の病理 びょうり 検査 けんさ 室 しつ レベルでは(2)が現在 げんざい では主流 しゅりゅう となっている。
標識 ひょうしき 酵素 こうそ としてペルオキシダーゼ を使用 しよう する場合 ばあい に、ペルオキシダーゼ・抗 こう ペルオキシダーゼ抗体 こうたい の可溶性 かようせい 免疫 めんえき 複 ふく 合体 がったい Peroxydase-anti-Peroxydase Complex(PAP)を用 もち いるPAP法 ほう [1] は、抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう のみを用 もち いてペルオキシダーゼを導入 どうにゅう するものである。一 いち 次 じ 抗体 こうたい と、抗 こう ペルオキシダーゼ抗体 こうたい のホスト動物 どうぶつ 種 しゅ を揃 そろ えておく。一 いち 次 じ 抗体 こうたい を反応 はんのう させ、それに結合 けつごう する二 に 価 か の二 に 次 じ 抗体 こうたい を反応 はんのう させた後 のち に、PAPを反応 はんのう させると、二 に 次 じ 抗体 こうたい のふたつの抗原 こうげん 結合 けつごう 部位 ぶい のうちの空 あ いている方 ほう が、PAPに含 ふく まれる抗 こう ペルオキシダーゼ抗体 こうたい に結合 けつごう する。
二 に 次 じ 抗体 こうたい にビオチン (biotin)を結合 けつごう (この場合 ばあい は「標識 ひょうしき 」とはいわず「ビオチン化 か 」という)させておき、3回 かい 目 め の反応 はんのう に抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう ではなくビオチンと特異 とくい 的 てき に結合 けつごう するアビジン (avidin)を用 もち いるLAB (Linked Avidin-Biotin)法 ほう 、アビジン・ビオチン複 ふく 合体 がったい Avidin-Biotin Complexを用 もち いるABC法 ほう [2] 、アビジンよりも強固 きょうこ なビオチンへの結合 けつごう を示 しめ すストレプトアビジン (streptavidin)を用 もち いるLSAB (Linked Streptavidin-Biotin)法 ほう などがある。また、さらに高 こう 感度 かんど かつ短時間 たんじかん で染色 せんしょく を可能 かのう とする方法 ほうほう も一般 いっぱん 的 てき になってきている。これは、二 に 次 じ 抗体 こうたい と酵素 こうそ をポリマーに結合 けつごう させたポリマー試薬 しやく を反応 はんのう させるため、内因 ないいん 性 せい のビオチンの影響 えいきょう を受 う けにくく、2ステップで反応 はんのう が終了 しゅうりょう するためである。その他 た に、TSA法 ほう (tyramide signal amplification, あるいはCARD法 ほう , catalyzed reporter deposition)という増 ぞう 感 かん 法 ほう も組 く み合 あ わせて使用 しよう することができる。
酵素 こうそ 抗体 こうたい 法 ほう での発色 はっしょく 方法 ほうほう としては何 なに 種類 しゅるい か選択肢 せんたくし があるが、最 もっと も一般 いっぱん 的 てき なものは標識 ひょうしき 酵素 こうそ としてペルオキシダーゼを用 もち いて、ジアミノベンジジン 英語 えいご 版 ばん と反応 はんのう させるDAB法 ほう [3] 、ニッケル イオン存在 そんざい 下 か でDAB法 ほう を行 おこな うより高 こう 感度 かんど のニッケルDAB法 ほう などである。標識 ひょうしき 酵素 こうそ としてアルカリホスファターゼ を使用 しよう する場合 ばあい には、NBT/BCIP反応 はんのう が最 もっと も一般 いっぱん 的 てき である。
腫瘍 しゅよう は病理 びょうり 組織 そしき 学 がく 的 てき に大 おお きく上皮 じょうひ 系 けい と間 あいだ 葉 は 系 けい に分類 ぶんるい される。多 おお くはHE染色 せんしょく でその分類 ぶんるい をすることが可能 かのう であるが、より正確 せいかく な診断 しんだん を行 おこな う目的 もくてき で免疫 めんえき 染色 せんしょく が用 もち いられる場合 ばあい がある。たいていの場合 ばあい 、上皮 じょうひ 系 けい マーカーとしてサイトケラチン 、間 あいだ 葉 は 系 けい のマーカーとしてビメンチン が用 もち いられる。
^ Sternberger LA, Hardy PH Jr, Cuculis JJ, Meyer HG. (1970). “The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry: preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes”. J Histochem Cytochem 18 (5): 315-33. PMID 4192899 .
^ Hsu SM, Raine L, Fanger H (1981). “Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures”. J Histochem Cytochem 29 (4): 577-80. PMID 6166661 .
^ Graham RC Jr, Karnovsky MJ. (1966). “The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique”. J Histochem Cytochem 14 (4): 291-302. PMID 5962951 .