オリンパス 製 せい の落射型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう ・鏡 かがみ 筒 とう 上 じょう にデジタルカメラ が接続 せつぞく されている。この蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう には微分 びぶん 干渉 かんしょう 顕微鏡 けんびきょう のユニットも組 く み込 こ まれている。
蛍光 けいこう 染色 せんしょく を行 おこな って蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう で観察 かんさつ したリンパ管 りんぱかん 内皮 ないひ 細胞 さいぼう
蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう (けいこうけんびきょう、Fluorescence microscope , Epifluorescent microscope, MFM )は、生体 せいたい または非 ひ 生体 せいたい 試料 しりょう からの蛍光 けいこう ・燐光 りんこう 現象 げんしょう を観察 かんさつ することによって、対象 たいしょう を観察 かんさつ する顕微鏡 けんびきょう である。反射 はんしゃ 光 こう や透過 とうか 光画 こうが 像 ぞう と同時 どうじ に観察 かんさつ することもある。生物 せいぶつ 学 がく ・医学 いがく における研究 けんきゅう 、臨床 りんしょう 検査 けんさ 、浸透 しんとう 探 さがせ 傷 きず 検査 けんさ などに用 もち いられる。
通常 つうじょう の光学 こうがく 顕微鏡 けんびきょう はタングステンランプ・ハロゲンランプなどを光源 こうげん として観察 かんさつ を行 おこな うが、蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう は蛍光 けいこう 性 せい をもった試料 しりょう を観察 かんさつ するために超 ちょう 高圧 こうあつ 水銀 すいぎん 灯 とう やキセノンランプ ・紫外線 しがいせん LED 、レーザー光 こう などを用 もち いて蛍光 けいこう 物質 ぶっしつ の励起 れいき 波長 はちょう での照明 しょうめい を可能 かのう としている。
励起 れいき 光 こう には近 きん 紫外線 しがいせん (UV励起 れいき ・334/365nm)・青色 あおいろ 光 こう (B励起 れいき ・405/435/490nm )・緑色 みどりいろ 光 こう (G励起 れいき ・546nm)などが用 もち いられる。励起 れいき 光源 こうげん には超 ちょう 高圧 こうあつ 水銀 すいぎん 灯 とう を用 もち いることが多 おお い。これは、紫外線 しがいせん での励起 れいき を行 おこな うことがあるためである。超 ちょう 高圧 こうあつ 水銀 すいぎん 灯 とう はその動作 どうさ 原理 げんり から専用 せんよう の高 こう 圧 あつ 電源 でんげん 装置 そうち が必要 ひつよう であり、定期 ていき 的 てき に水銀 すいぎん 電球 でんきゅう の交換 こうかん も必要 ひつよう である。そのため、近年 きんねん は小型 こがた 化 か とメンテナンスの容易 たやす さを狙 ねら って紫外線 しがいせん LEDを用 もち いた製品 せいひん も開発 かいはつ されている。
紫外線 しがいせん を用 もち いる場合 ばあい には、被曝 ひばく によって人体 じんたい への悪影響 あくえいきょう が発生 はっせい する可能 かのう 性 せい があるため、紫外線 しがいせん が散乱 さんらん する部位 ぶい の周囲 しゅうい には紫外線 しがいせん カットフィルタを設 もう けるなどして人体 じんたい の保護 ほご を行 おこな う。超 ちょう 高圧 こうあつ 水銀 すいぎん 灯 とう から発生 はっせい する光 ひかり は人体 じんたい に有害 ゆうがい 性 せい の特 とく に大 おお きいUV-Cを含 ふく む。
構造 こうぞう 的 てき には透過 とうか 型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう と落射型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう に大別 たいべつ される。透過 とうか 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう の方 ほう が構造 こうぞう が簡単 かんたん で歴史 れきし も古 ふる いが、現在 げんざい では技術 ぎじゅつ 革新 かくしん の結果 けっか から高性能 こうせいのう 化 か の余地 よち が大 おお きい落射型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう が中心 ちゅうしん となっている。
通常 つうじょう の光学 こうがく 顕微鏡 けんびきょう (生物 せいぶつ 顕微鏡 けんびきょう )のように、下方 かほう から励起 れいき 光 こう を照射 しょうしゃ する。このとき光源 こうげん にフィルタ(励起 れいき フィルタ)を取 と り付 つ け、励起 れいき 光 こう の波長 はちょう のみを照射 しょうしゃ する。
暗 くら 視野 しや コンデンサを用 もち い、試料 しりょう プレパラートに励起 れいき 光 こう を当 あ てる
試料 しりょう から発生 はっせい した蛍光 けいこう と、試料 しりょう によって散乱 さんらん された励起 れいき 光 こう のみが接眼 せつがん 部 ぶ に向 む かう
目的 もくてき とする蛍光 けいこう の波長 はちょう のみを透過 とうか するフィルタ(吸収 きゅうしゅう フィルタ)を用 もち い、蛍光 けいこう のみを取 と り出 だ す
蛍光 けいこう を観察 かんさつ する
落射型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう の原理 げんり 右 みぎ の光源 こうげん から出 で た光 ひかり (虹色 にじいろ のライン)は励起 れいき フィルタで励起 れいき 波長 はちょう の光 ひかり のみに制限 せいげん されて励起 れいき 光 こう (紺色 こんいろ のライン)となる。 励起 れいき 光 こう はダイクロイックミラーで反射 はんしゃ され、対物 たいぶつ レンズを通 とお して試料 しりょう を照明 しょうめい する。 励起 れいき された試料 しりょう から発生 はっせい した蛍光 けいこう (黄 き 緑色 みどりいろ のライン)は対物 たいぶつ レンズを通 とお して接眼 せつがん 部 ぶ に向 む かう。 蛍光 けいこう はダイクロイックミラーで反射 はんしゃ されず直進 ちょくしん する。 吸収 きゅうしゅう フィルタでは蛍光 けいこう 以外 いがい の波長 はちょう の光 ひかり が除 のぞ かれる。 蛍光 けいこう は接眼 せつがん 部 ぶ に届 とど き、肉眼 にくがん で観察 かんさつ /カメラ等 とう で撮影 さつえい される
落射照明 しょうめい (同軸 どうじく 照明 しょうめい )で励起 れいき 光 こう を照射 しょうしゃ する。落射照明 しょうめい の反射 はんしゃ 鏡 きょう としてダイクロイックミラー を用 もち い(励起 れいき フィルタを補助 ほじょ 的 てき に用 もち いることもある)、励起 れいき 光 こう の波長 はちょう のみを試料 しりょう に照射 しょうしゃ する。
試料 しりょう から発生 はっせい した蛍光 けいこう と、試料 しりょう によって散乱 さんらん された励起 れいき 光 こう のみが接眼 せつがん 部 ぶ に向 む かう
目的 もくてき とする蛍光 けいこう の波長 はちょう のみを透過 とうか する吸収 きゅうしゅう フィルタを用 もち い、蛍光 けいこう のみを取 と り出 だ す
蛍光 けいこう を観察 かんさつ する
透過 とうか 型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう は構造 こうぞう が簡単 かんたん で安価 あんか であったが、励起 れいき 光 こう の強度 きょうど を上 あ げるのに限界 げんかい があること、位相 いそう 差 さ 観察 かんさつ と組 く み合 あ わせることができないこと・厚 あつ みのある試料 しりょう は接眼 せつがん レンズ側 がわ で蛍光 けいこう を発生 はっせい させることが難 むずか しいことなどから関連 かんれん 光学 こうがく 技術 ぎじゅつ の革新 かくしん が進 すす んだ現在 げんざい では落射型 がた 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう が主流 しゅりゅう である。なお、光源 こうげん の付 つ け替 が えによって透過 とうか ・落射の両方 りょうほう の観察 かんさつ 法 ほう に対応 たいおう している顕微鏡 けんびきょう もある。
ツァイス社 しゃ のフルオール対物 たいぶつ レンズ
対物 たいぶつ レンズを通 とお して励起 れいき 光 こう を照射 しょうしゃ するという原理 げんり 上 じょう 、紫外線 しがいせん を用 もち いた励起 れいき を行 おこな うには紫外線 しがいせん の透過 とうか 率 りつ が高 たか く、レンズ素材 そざい による蛍光 けいこう の発生 はっせい (自家 じか 蛍光 けいこう 、後述 こうじゅつ )の少 すく ない対物 たいぶつ レンズ が必要 ひつよう である。この目的 もくてき に開発 かいはつ された対物 たいぶつ レンズはフルオール(Fluor/Fluar,ドイツ語 ご で蛍 ぼたる 石 せき を意味 いみ する・FLとも略 りゃく される)と呼 よ ばれる。
ヘキスト染色 せんしょく を行 おこな って観察 かんさつ したHeLa細胞 さいぼう 。染色 せんしょく 体 たい のみが染色 せんしょく されている。
蛍光 けいこう 観察 かんさつ のための特殊 とくしゅ な染色 せんしょく 法 ほう として、蛍光 けいこう 染色 せんしょく ・化学 かがく 的 てき 蛍光 けいこう 染色 せんしょく ・抗体 こうたい 蛍光 けいこう 染色 せんしょく などが行 おこな われる。
蛍光 けいこう 染色 せんしょく では各 かく 細胞 さいぼう 内 ない 小 しょう 器官 きかん やpH ・イオン などに対 たい して染色 せんしょく 性 せい の特異 とくい 性 せい が高 たか い蛍光 けいこう 色素 しきそ を用 もち い、蛍光 けいこう 染色 せんしょく が行 おこな われる。場合 ばあい によっては複数 ふくすう の蛍光 けいこう 色素 しきそ を用 もち い、器官 きかん ごとに染 そ め分 わ けること(多重 たじゅう 染色 せんしょく )も行 おこな われる。
蛍光 けいこう 色素 しきそ にはDAPI ・ローダミン ・フルオレセイン やその類縁 るいえん 化合 かごう 物 ぶつ などが用 もち いられる。化学 かがく 物質 ぶっしつ の他 ほか に、粒 つぶ 径 みち に応 おう じて様々 さまざま な蛍光 けいこう 特性 とくせい を持 も つ量子 りょうし ドット も染色 せんしょく に用 もち いられる。
抗体 こうたい 蛍光 けいこう 染色 せんしょく では抗原 こうげん 抗体 こうたい 反応 はんのう を利用 りよう し、蛍光 けいこう 色素 しきそ で標識 ひょうしき (蛍光 けいこう ラベル)した抗体 こうたい を試料 しりょう に取 と り込 こ ませて染色 せんしょく を行 おこな う。抗原 こうげん となる物質 ぶっしつ に対 たい して高 たか い特異 とくい 性 せい で染色 せんしょく が行 おこな えるため、臨床 りんしょう 検査 けんさ などに用 もち いられる。
これらの蛍光 けいこう 色素 しきそ は、照射 しょうしゃ する励起 れいき 光 こう の強度 きょうど が高 たか すぎると褪色 たいしょく してしまうことがある。そのため励起 れいき 光 こう の強 つよ さを絞 しぼ ったり、褪色 たいしょく 防止 ぼうし 剤 ざい を加 くわ えるなどの対策 たいさく が行 おこな われる。
化学 かがく 的 てき 蛍光 けいこう 染色 せんしょく では、試料 しりょう を試薬 しやく で処理 しょり して蛍光 けいこう 性 せい の物質 ぶっしつ に転換 てんかん させ、蛍光 けいこう 性 せい となった部位 ぶい を観察 かんさつ する手法 しゅほう である。
他 た に、緑色 みどりいろ 蛍光 けいこう タンパク質 たんぱくしつ (GFP) などの蛍光 けいこう タンパク質 たんぱくしつ を誘導 ゆうどう する遺伝子 いでんし を遺伝子 いでんし 組 く み替 か え によって導入 どうにゅう し、観察 かんさつ する手法 しゅほう もある。(これについてはレポーター遺伝子 いでんし で詳述 しょうじゅつ されている)
試料 しりょう から発生 はっせい する蛍光 けいこう は、一般 いっぱん 的 てき に励起 れいき 光 こう に対 たい して極 きわ めて微弱 びじゃく であるため、S/N比 ひ を向上 こうじょう させるために観測 かんそく 場所 ばしょ を暗黒 あんこく 状態 じょうたい にするなどの必要 ひつよう がある。近年 きんねん は冷却 れいきゃく CCDカメラ などの観測 かんそく 装置 そうち を用 もち い、長時間 ちょうじかん の露出 ろしゅつ を行 おこな って極 きわ めて微弱 びじゃく な蛍光 けいこう でも観察 かんさつ し、画像 がぞう 処理 しょり によって高 たか い解像度 かいぞうど ・コントラストを得 え ることができるようになった。
試料 しりょう によっては、観察 かんさつ 対象 たいしょう となる部位 ぶい 以外 いがい から蛍光 けいこう が発生 はっせい し、これが背景 はいけい ノイズとなって観察 かんさつ の邪魔 じゃま になることがある。この現象 げんしょう を“自家 じか 蛍光 けいこう ”と呼 よ ぶ。生物 せいぶつ 試料 しりょう で特 とく に問題 もんだい になるのはクロロフィル b ・コラーゲン ・フィブリリン ・フラビン ・インドールアミン類 るい ・NADH ・NADPH ・ポリフェノール 類 るい ・トリプトファン などが挙 あ げられる。この現象 げんしょう をクリアするために、対象 たいしょう 物質 ぶっしつ を化学 かがく 的 てき に除 のぞ く、問題 もんだい となる物質 ぶっしつ が蛍光 けいこう しない波長 はちょう で励起 れいき を行 おこな うなどの手法 しゅほう がある。
また、試料 しりょう に混在 こんざい する物質 ぶっしつ 以外 いがい にも、スライドガラス やカバーガラス ・油 あぶら 浸 ひた 用 よう オイル・顕微鏡 けんびきょう に使用 しよう されているレンズ材 ざい などが自家 じか 蛍光 けいこう を起 お こすこともある。蛍光 けいこう が微弱 びじゃく である試料 しりょう を扱 あつか う場合 ばあい には低 てい 蛍光 けいこう 性 せい ガラスを用 もち いたスライドガラス・カバーガラスを使用 しよう することが求 もと められる。
共 きょう 焦点 しょうてん レーザー顕微鏡 けんびきょう は励起 れいき 波長 はちょう のレーザー で多段 ただん スキャン照射 しょうしゃ を行 おこな い、得 え られた蛍光 けいこう を合成 ごうせい することにより擬似 ぎじ 的 てき に被 ひ 写 うつし 界 かい 深度 しんど を極 きわ めて深 ふか くとることができる顕微鏡 けんびきょう である。これにより試料 しりょう の3次元 じげん 構造 こうぞう を観察 かんさつ 可能 かのう である。
全 ぜん 反射 はんしゃ 照明 しょうめい 蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう はエバネッセント場 じょう を利用 りよう した局所 きょくしょ 的 てき な励起 れいき を行 おこな い、極 きわ めて被 ひ 写 うつし 界 かい 深度 しんど を浅 あさ くすることが可能 かのう である。場合 ばあい によっては一 いち 分子 ぶんし の蛍光 けいこう 分子 ぶんし の挙動 きょどう を観測 かんそく することもでき、一 いち 分子 ぶんし 細胞 さいぼう 生物 せいぶつ 学 がく ・生理学 せいりがく の発展 はってん に貢献 こうけん している。
Bradbury, S. and Evennett, P., Fluorescence microscopy., Contrast Techniques in Light Microscopy., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, United Kingdom (1996).
Rost, F. and Oldfield, R., Fluorescence microscopy., Photography with a Microscope, Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom (2000).