ウイルスの定量 ていりょう は、ウイルス濃度 のうど を測定 そくてい するために特定 とくてい の容量 ようりょう 内 ない のウイルス の数 かず を数 かぞ えること。産業 さんぎょう ・学術 がくじゅつ などでの研究 けんきゅう 開発 かいはつ (R&D)のみならず、製造 せいぞう でもさまざまな工程 こうてい においてウイルスの量 りょう が重要 じゅうよう になることから必要 ひつよう になる。たとえば、ウイルスワクチン や、ウイルスベクターを使用 しよう した組 くみ 換 か えタンパク質 たんぱくしつ 、ウイルス抗原 こうげん の生産 せいさん では、生産 せいさん 収量 しゅうりょう を最適 さいてき 化 か し、常 つね に変化 へんか する需要 じゅよう や用途 ようと に対応 たいおう するため、プロセスを継続 けいぞく 的 てき に適応 てきおう ・監 かん 視 し する目的 もくてき でウイルス定量 ていりょう を必要 ひつよう とする。既知 きち のウイルスを定量 ていりょう 化 か する必要 ひつよう がある例 れい として、クローンスクリーニング、感染 かんせん 多重 たじゅう 度 ど (MOI)の最適 さいてき 化 か 、細胞 さいぼう 培養 ばいよう 法 ほう の改良 かいりょう などがある。この項 こう では、液体 えきたい サンプル中 ちゅう のウイルスを定量 ていりょう 化 か するために現在 げんざい 使用 しよう されているさまざまな手法 しゅほう について説明 せつめい する。手法 しゅほう は従来 じゅうらい の手法 しゅほう と最新 さいしん の手法 しゅほう の2つのカテゴリに分 わ けられる。従来 じゅうらい の手法 しゅほう は、何 なん 十 じゅう 年 ねん にもわたって使用 しよう されてきた業界 ぎょうかい 標準 ひょうじゅん の手法 しゅほう であるが、一般 いっぱん 的 てき に時間 じかん がかかり、労力 ろうりょく を必要 ひつよう とする。最新 さいしん の手法 しゅほう は、定量 ていりょう 化 か 時間 じかん を大幅 おおはば に短縮 たんしゅく する比較的 ひかくてき 新 あたら しい市販 しはん の製品 せいひん やキットである。ただし、すべての手法 しゅほう の網羅 もうら 的 てき なレビューではなく、従来 じゅうらい の手法 しゅほう と新 あたら しい市販 しはん の手法 しゅほう の代表 だいひょう 例 れい を示 しめ す。ウイルスの定量 ていりょう 化 か には他 ほか にも公開 こうかい された方法 ほうほう が存在 そんざい する可能 かのう 性 せい があるが、ここでは非 ひ 商用 しょうよう の手法 しゅほう については説明 せつめい しない。
単純 たんじゅん ヘルペスウイルスのプラーク
プラークベースのアッセイは、感染 かんせん 量 りょう からウイルス濃度 のうど を測定 そくてい する標準 ひょうじゅん 的 てき な方法 ほうほう である。プラーク アッセイは、ウイルス量 りょう の1つの尺度 しゃくど であるウイルスサンプル中 ちゅう のプラーク形成 けいせい 単位 たんい (pfu)の数 かず を測定 そくてい する。この測定 そくてい 法 ほう は、ペトリ皿 さら またはマルチウェルプレートで実施 じっし される微生物 びせいぶつ 学 がく 的 てき 手法 しゅほう であり、具体 ぐたい 的 てき には、コンフルエントな単 たん 層 そう の宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう に、さまざまな希釈 きしゃく 率 りつ でウイルスを感染 かんせん させ、寒天 かんてん やカルボキシメチルセルロース などの半 はん 固体 こたい 培地 ばいち で覆 おお って、ウイルス感染 かんせん が際限 さいげん なく広 ひろ がるのを防 ふせ ぐ。ウイルスプラークは、ウイルスが固定 こてい 細胞 さいぼう 単 たん 層 そう 内 ない の細胞 さいぼう に感染 かんせん すると形成 けいせい される[ 1] 。ウイルスに感染 かんせん した細胞 さいぼう は溶解 ようかい し、隣接 りんせつ する細胞 さいぼう に感染 かんせん を広 ひろ げ、感染 かんせん から溶解 ようかい までのサイクルが繰 く り返 かえ される。感染 かんせん した細胞 さいぼう 領域 りょういき は、光学 こうがく 顕微鏡 けんびきょう または視覚 しかく 的 てき に見 み ることができるプラーク(感染 かんせん していない細胞 さいぼう に囲 かこ まれた感染 かんせん 領域 りょういき )を形成 けいせい する。操作 そうさ の具体 ぐたい 例 れい としては、重層 じゅうそう した培地 ばいち を洗 あら い流 なが し、細胞 さいぼう 質 しつ が着色 ちゃくしょく するまでクリスタルバイオレット 溶液 ようえき を添加 てんか し15分間 ふんかん 静 しずか 置 おけ する。余分 よぶん な染色 せんしょく 液 えき を水 みず で静 しず かに取 と り除 のぞ くと、死 し んだ細胞 さいぼう の位置 いち が無 む 着色 ちゃくしょく で示 しめ される[ 2] 。プラークの形成 けいせい には、分析 ぶんせき するウイルスによって異 こと なるが、3〜14日 にち かかる場合 ばあい がある。プラークは通常 つうじょう 手動 しゅどう でカウントされ、その結果 けっか は、プレートの調製 ちょうせい に使用 しよう された希釈 きしゃく 倍率 ばいりつ を乗 じょう じてサンプル単位 たんい 体積 たいせき あたりのプラーク形成 けいせい 単位 たんい の数 かず (pfu/mL)を計算 けいさん する。 pfu/mLの結果 けっか は、サンプル内 ない の感染 かんせん 性 せい 粒子 りゅうし の数 かず を表 あらわ し、形成 けいせい された各 かく プラークが1つの感染 かんせん 性 せい ウイルス粒子 りゅうし を表 あらわ すという仮定 かてい に基 もと づいた数 かず である[ 3] [ 4] 。
ロタウイルスに 感染 かんせん した細胞 さいぼう (上 うえ )と感染 かんせん していない細胞 さいぼう (下 した )
フォーカス形成 けいせい アッセイ(FFA)はプラークアッセイの一部 いちぶ であるが、FFAはウイルス抗原 こうげん に特異 とくい 的 てき な蛍光 けいこう 標識 ひょうしき 抗体 こうたい を使用 しよう して、感染 かんせん した宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう とプラークが形成 けいせい される前 まえ の感染 かんせん ウイルス粒子 りゅうし を検出 けんしゅつ する免疫 めんえき 染色 せんしょく 技術 ぎじゅつ を用 もち いる。 FFAは、プラーク形成 けいせい と異 こと なり細胞 さいぼう 溶解 ようかい を必要 ひつよう としないことから、細胞 さいぼう 膜 まく を溶解 ようかい しないプラークアッセイに適 てき さないウイルス種 しゅ の定量 ていりょう に特 とく に用 もち いられる。プラークアッセイと同様 どうよう に、単 たん 層 そう の宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう に段階 だんかい 希釈 きしゃく したウイルスサンプルを感染 かんせん させ、感染 かんせん 性 せい ウイルスの拡散 かくさん を制限 せいげん する半 はん 固体 こたい 重層 じゅうそう 培地 ばいち の下 した で比較的 ひかくてき 短 みじか い培養 ばいよう 時間 じかん (24〜72時 じ 間 あいだ など)インキュベートし、局所 きょくしょ 的 てき な感染 かんせん 細胞 さいぼう のクラスター(フォーカス、病巣 びょうそう )を形成 けいせい する。続 つづ いてプレートをウイルス抗原 こうげん に対 たい する蛍光 けいこう 標識 ひょうしき 抗体 こうたい で染色 せんしょく し、蛍光 けいこう 顕微鏡 けんびきょう を使用 しよう してフォーカスの数 かず を数 かぞ え、定量 ていりょう する。 FFA法 ほう では、通常 つうじょう 、プラークや50%組織 そしき 培養 ばいよう 感染 かんせん 量 りょう (TCID50 )アッセイよりも短時間 たんじかん で結果 けっか が得 え られるが、必要 ひつよう な試薬 しやく や機器 きき の点 てん で高価 こうか になることがある。測定 そくてい 時間 じかん は、測定 そくてい 者 しゃ が数 かぞ える領域 りょういき のサイズにも依存 いぞん する。より大 おお きな領域 りょういき はより多 おお くの時間 じかん を必要 ひつよう とするが、より正確 せいかく な値 ね となる。 FFAの結果 けっか は、ミリリットルあたりのフォーカス形成 けいせい 単位 たんい (FFU/mL)として表 あらわ される。
50%組織 そしき 培養 ばいよう 感染 かんせん 量 りょう (50% Tissue Culture Infective Dose: TCID50 )は、感染 かんせん 性 せい のウイルス力 ちから 価 か の尺度 しゃくど である。TCID50 は接種 せっしゅ された組織 そしき 培養 ばいよう 細胞 さいぼう の50%を殺 ころ す、あるいは細胞 さいぼう 変性 へんせい 効果 こうか を生 う むのに必要 ひつよう なウイルスの量 りょう を定量 ていりょう する。TCID50 は臨床 りんしょう 研究 けんきゅう などにおいてウイルスの致死 ちし 量 りょう を決定 けってい する必要 ひつよう がある場合 ばあい や、ウイルスがプラークを形成 けいせい しない場合 ばあい によく用 もち いられる。組織 そしき 培養 ばいよう での操作 そうさ 例 れい として、宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう を播種 はしゅ し、段階 だんかい 希釈 きしゃく したウイルスを添加 てんか 、培養 ばいよう 後 ご 、死滅 しめつ した細胞 さいぼう (感染 かんせん 細胞 さいぼう )の割合 わりあい を手動 しゅどう で観察 かんさつ する。各 かく ウイルス希釈 きしゃく での割合 わりあい を記録 きろく し、結果 けっか から数学 すうがく 的 てき にTCID50 を計算 けいさん する[ 5] 。測定 そくてい 方法 ほうほう や測定 そくてい 原理 げんり の違 ちが いから、TCID50 やPFU/ml、他 た の感染 かんせん 性 せい アッセイの結果 けっか は等価 とうか ではない。この手法 しゅほう は、細胞 さいぼう の感染 かんせん が必要 ひつよう であり、最大 さいだい 1週間 しゅうかん かかる場合 ばあい がある[ 6] 。
TCID50 計算 けいさん には、一般 いっぱん 的 てき に以下 いか の2つの計算 けいさん 方法 ほうほう が使用 しよう される(EC50 、IC50 、LD50 などの他 ほか のタイプの50%エンドポイントの計算 けいさん にも使用 しよう される)
数学 すうがく 的 てき には、TCID50 で陰性 いんせい だったウェルは0個 こ のプラーク形成 けいせい 単位 たんい を表 あらわ し、陽性 ようせい だったウェルはそれぞれ1個 いっこ 以上 いじょう のプラーク形成 けいせい 単位 たんい を表 あらわ すので、予想 よそう されるPFUはTCID50 の2分 ぶん の1よりも若干 じゃっかん 大 おお きくなる。ポアソン分布 ぶんぷ に基 もと づくと、より正確 せいかく な推定 すいてい 値 ち が得 え られ、約 やく 0.69 PFU = 1 TCID50 である[ 8] 。ポアソン分布 ぶんぷ は、一定 いってい の空間 くうかん において、既知 きち の平均 へいきん 発生 はっせい 確 かく 率 りつ で発生 はっせい するランダムなイベントの発生 はっせい 回数 かいすう を表 あらわ す確 かく 率 りつ 分布 ぶんぷ である。観測 かんそく された陰性 いんせい のウェルは感染 かんせん イベントが0回 かい 発生 はっせい したとみなされることから、P(0)は陰性 いんせい のウェルの比率 ひりつ であり、mは体積 たいせき あたりの感染 かんせん 単位 たんい の平均 へいきん 数 すう (PFU/ml)であることから、P(0) = e-m である。TCID50 として表 あらわ される力 ちから 価 か の場合 ばあい 、P(0) = 0.5であるから、e-m = 0.5、すなわちm = -ln 0.5であり、これは約 やく 0.69と計算 けいさん される。ただし、実際 じっさい には、この関係 かんけい は同 おな じウイルスと細胞 さいぼう の組 く み合 あ わせでも当 あ てはまらないことがある。これは、2種類 しゅるい の測定 そくてい 法 ほう の測定 そくてい 条件 じょうけん が異 こと なることや、ウイルスの感染 かんせん 力 りょく は細胞 さいぼう 年齢 ねんれい 、重層 じゅうそう 培地 ばいち 等 とう に非常 ひじょう に影響 えいきょう を受 う けやすいことによる。しかし、次 つぎ の文献 ぶんけん では、この関係 かんけい を異 こと なる形 かたち で定義 ていぎ している。同 おな じ細胞 さいぼう 系 けい を使用 しよう し、ウイルスがそれらの細胞 さいぼう 上 じょう でプラークを形成 けいせい し、プラーク形成 けいせい を阻害 そがい するような処置 しょち を加 くわ えないと仮定 かてい すると、1 mlのウイルスストックはTCID50 の約 やく 半分 はんぶん の数 かず のプラーク形成 けいせい 単位 たんい (PFU)を持 も つことが予想 よそう される。これは推定 すいてい に過 す ぎないが、添加 てんか した細胞 さいぼう 層 そう の50%に感染 かんせん する限界 げんかい 希釈 きしゃく 液 えき では、感染 かんせん した細胞 さいぼう 層 そう に最初 さいしょ に1つのプラークができると予想 よそう されることが多 おお いという根拠 こんきょ に基 もと づいている。場合 ばあい によっては、偶然 ぐうぜん にも2つ以上 いじょう のプラークが形成 けいせい されることもあるので、実際 じっさい のPFU数 すう は実験 じっけん 的 てき に決定 けってい されるべきである。(ATCC - Converting TCID50 to plaque forming units PFU-124 を参照 さんしょう )
タンパク質 たんぱくしつ ベースのウイルス定量 ていりょう 法 ほう にはいくつかの種類 しゅるい がある。一般 いっぱん に、タンパク質 たんぱくしつ 定量 ていりょう では、感染 かんせん した細胞 さいぼう やウイルス粒子 りゅうし の数 かず ではなく、サンプル中 ちゅう の総 そう タンパク質 たんぱくしつ 量 りょう か、特定 とくてい のウイルスタンパク質 たんぱくしつ の量 りょう のいずれかを定量 ていりょう する。一般 いっぱん 的 てき には蛍光 けいこう 検出 けんしゅつ によって定量 ていりょう することが最 もっと も多 おお い。サンプル中 ちゅう のタンパク質 たんぱくしつ を直接 ちょくせつ 定量 ていりょう する方法 ほうほう もあるが、タンパク質 たんぱくしつ 定量 ていりょう の前 まえ に宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう に感染 かんせん させ、培養 ばいよう してウイルスの増殖 ぞうしょく する場合 ばあい もある。サンプル中 ちゅう のタンパク質 たんぱくしつ (すなわちウイルス)の量 りょう と測定 そくてい 法 ほう 自体 じたい の感度 かんど に応 おう じて使用 しよう する測定 そくてい 法 ほう が選 えら ばれる。ウイルスの増幅 ぞうふく が必要 ひつよう な場合 ばあい 、分析 ぶんせき 前 まえ に細胞 さいぼう やウイルスの溶解 ようかい ・分解 ぶんかい が行 おこな われることが多 おお い。ほとんどのタンパク質 たんぱくしつ ベースの測定 そくてい 法 ほう は比較的 ひかくてき 迅速 じんそく で感度 かんど が高 たか いが、正確 せいかく な定量 ていりょう には標準 ひょうじゅん 品 ひん を必要 ひつよう とし、実際 じっさい のウイルス粒子 りゅうし 濃度 のうど ではなくタンパク質 たんぱくしつ を定量 ていりょう している。以下 いか は、広 ひろ く使用 しよう されているタンパク質 たんぱくしつ ベースの定量 ていりょう 法 ほう の具体 ぐたい 例 れい である。
血球 けっきゅう 凝集 ぎょうしゅう アッセイ(HA)は、インフルエンザ ウイルスの定量 ていりょう に代表 だいひょう される一般 いっぱん 的 てき な非 ひ 蛍光 けいこう タンパク質 たんぱくしつ 定量 ていりょう 法 ほう である。インフルエンザウイルスの表面 ひょうめん タンパク質 たんぱくしつ である血球 けっきゅう 凝集 ぎょうしゅう 素 もと が赤血球 せっけっきゅう を凝集 ぎょうしゅう させる反応 はんのう により定量 ていりょう している。この定量 ていりょう 法 ほう では、インフルエンザサンプルの希釈 きしゃく 液 えき を1%赤血球 せっけっきゅう 溶液 ようえき と1時 じ 間 あいだ 培養 ばいよう し、凝集 ぎょうしゅう が最初 さいしょ に発生 はっせい するウイルス希釈 きしゃく 液 えき を目視 もくし で確認 かくにん する。この定量 ていりょう 法 ほう の結果 けっか は赤血球 せっけっきゅう 凝集 ぎょうしゅう 単位 たんい (hemagglutination units: HAU)の形 かたち で得 え られ、通常 つうじょう 、PFUに対 たい する比率 ひりつ は106 の範囲 はんい である [ 9] [ 10] 。この定量 ていりょう 法 ほう は測定 そくてい に約 やく 1〜2時 じ 間 あいだ かかり、測定 そくてい 結果 けっか は操作 そうさ 者 しゃ の技術 ぎじゅつ や経験 けいけん によって大 おお きく異 こと なることがある。
血球 けっきゅう 凝集 ぎょうしゅう 阻害 そがい アッセイ(HI)は、血清 けっせい 中 ちゅう のインフルエンザ特異 とくい 的 てき 抗体 こうたい 濃度 のうど の測定 そくてい によく用 もち いられるHAアッセイのうちの一 いち 手法 しゅほう である。血清 けっせい 中 ちゅう にインフルエンザウイルスに対 たい する抗体 こうたい が十分 じゅうぶん な濃度 のうど で存在 そんざい する場合 ばあい 、ウイルスの赤血球 せっけっきゅう への付着 ふちゃく が妨害 ぼうがい され、血球 けっきゅう 凝集 ぎょうしゅう 反応 はんのう が阻害 そがい されることを利用 りよう した測定 そくてい 法 ほう である[ 11] 。
ビシンコニン酸 さん アッセイ(BCA)は、単純 たんじゅん な比 ひ 色 しょく 測定 そくてい による最 もっと も一般 いっぱん 的 てき なタンパク質 たんぱくしつ 定量 ていりょう 分析 ぶんせき 法 ほう である。 BCAはLowry法 ほう やBradford法 ほう に類似 るいじ しており、現在 げんざい Thermo Fisher Scientific 社 しゃ となっているPierce社 しゃ によって最初 さいしょ に市販 しはん 化 か された。 BCAアッセイでは、タンパク質 たんぱくしつ のペプチド結合 けつごう がCu2+ をCu1+ に定量 ていりょう 的 てき に還元 かんげん し、薄 うす い青色 あおいろ を呈 てい する。BCAはCu1+ を2:1の比率 ひりつ でキレート し、562 nmに吸収 きゅうしゅう を持 も つより濃 こ い色 いろ の錯体 さくたい を形成 けいせい する。分光 ぶんこう 光度 こうど 計 けい またはプレートリーダーで562 nmでの試料 しりょう の吸光度 ど を測定 そくてい し、既知 きち の標準 ひょうじゅん 曲線 きょくせん と比較 ひかく することで、試料 しりょう 中 ちゅう の総 そう タンパク質 たんぱくしつ 濃度 のうど を測定 そくてい することができる[ 12] 。分析 ぶんせき の所要 しょよう 時間 じかん は30分 ふん 〜1時 じ 間 あいだ ほどである。この分析 ぶんせき 法 ほう は汎用 はんよう 的 てき で高速 こうそく だが、すべてのタンパク質 たんぱくしつ を定量 ていりょう するため特異 とくい 性 せい に欠 か け、定量 ていりょう するウイルス試料 しりょう 中 ちゅう の宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう 由来 ゆらい タンパク質 たんぱくしつ の混入 こんにゅう が非常 ひじょう に低 てい 濃度 のうど である必要 ひつよう がある。
一元 いちげん 放射状 ほうしゃじょう 免疫 めんえき 拡散 かくさん 法 ほう [ 編集 へんしゅう ]
一元 いちげん 放射状 ほうしゃじょう 免疫 めんえき 拡散 かくさん 法 ほう (single radial immunodiffusion method;SRID法 ほう )は、マンチーニ法 ほう とも呼 よ ばれ、半 はん 固形 こけい 培地 ばいち (寒天 かんてん など)上 じょう での拡散 かくさん によって特定 とくてい のウイルス抗原 こうげん の量 りょう を検出 けんしゅつ するタンパク質 たんぱくしつ 定量 ていりょう 分析 ぶんせき である。目的 もくてき の抗原 こうげん に特異 とくい 的 てき な抗 こう 血清 けっせい を含 ふく む培地 ばいち の上 うえ に、抗原 こうげん を含 ふく む円筒 えんとう 状 じょう のディスクを中央 ちゅうおう に置 お く。抗原 こうげん は培地 ばいち に放射状 ほうしゃじょう に拡散 かくさん し、平衡 へいこう に達 たっ するまで成長 せいちょう する免疫 めんえき 沈降 ちんこう のリングが形成 けいせい される。測定 そくてい 時間 じかん は、抗原 こうげん と抗体 こうたい の平衡 へいこう 時間 じかん に応 おう じて、10時 じ 間 あいだ から数日 すうじつ の範囲 はんい である。リングの直径 ちょっけい は、タンパク質 たんぱくしつ 濃度 のうど の対数 たいすう と直線 ちょくせん 関係 かんけい にあり、定量 ていりょう には既知 きち のタンパク質 たんぱくしつ 標準 ひょうじゅん の直径 ちょっけい と比較 ひかく する[ 13] 。いくつかのキットと血清 けっせい がこの分析 ぶんせき 用 よう に市販 しはん されている(例 れい :バインディングサイト株式会社 かぶしきがいしゃ )。
ポリオウイルスのネガティブ染色 せんしょく TEM(バー: 50 nm)
新型 しんがた H1N1ビリオンの組織 そしき 包 つつみ 埋 うめ 切片 せっぺん
透過 とうか 型 がた 電子 でんし 顕微鏡 けんびきょう (Transmission Electron Microscope; TEM) は、磁場 じば で集束 しゅうそく した電子 でんし 線 せん をサンプルにあて画像 がぞう 化 か する電子 でんし 顕微鏡 けんびきょう の一種 いっしゅ であり、光学 こうがく 顕微鏡 けんびきょう の1000倍 ばい (0.2 nm)の空間 くうかん 分解能 ぶんかいのう を持 も つ[ 14] 。極 きょく 薄 うす くしたネガティブ染色 せんしょく のサンプルが必要 ひつよう であり、サンプルの準備 じゅんび として、コーティングしたTEMグリッドと呼 よ ばれる金属 きんぞく 板 ばん の上 うえ への標本 ひょうほん を載 の せ、電子 でんし 不 ふ 透過 とうか 性 せい の液体 えきたい によりネガティブ染色 せんしょく を行 おこな う[ 15] 。 組織 そしき に埋没 まいぼつ しているサンプルは、薄 うす く切片 せっぺん 化 か すれば検査 けんさ 可能 かのう である。サンプルの準備 じゅんび はプロトコルと実験 じっけん 者 しゃ によって異 こと なるが、通常 つうじょう 、数時間 すうじかん かかる。 TEM画像 がぞう は個々 ここ のウイルス粒子 りゅうし を観察 かんさつ でき、定量 ていりょう 的 てき 画像 がぞう 分析 ぶんせき によりウイルス濃度 のうど の測定 そくてい も可能 かのう である。TEMによる高 こう 解像度 かいぞうど 画像 がぞう は、他 た の方法 ほうほう では難 むずか しい粒子 りゅうし の形態 けいたい 情報 じょうほう を得 え ることができる。感染 かんせん 力 りょく の有無 うむ に関係 かんけい なく、すべての粒子 りゅうし の数 かず を1 mLあたりのウイルス様 さま 粒子 りゅうし 数 かず (vlp/mL)として定量 ていりょう するため、定量 ていりょう 的 てき TEMの結果 けっか は他 た の分析 ぶんせき 結果 けっか よりも大 おお きくなることが多 おお い。定量 ていりょう 的 てき TEMは一般 いっぱん に106 粒子 りゅうし /mLを超 こ えるウイルス濃度 のうど に適用 てきよう できる。機器 きき のコストが高 たか く、必要 ひつよう なスペースとサポート施設 しせつ が必要 ひつよう なため、TEMが利用 りよう できる施設 しせつ は限 かぎ られている。
調整 ちょうせい 可能 かのう 抵抗 ていこう パルスセンシング(TRPS)[ 編集 へんしゅう ]
調整 ちょうせい 可能 かのう 抵抗 ていこう 性 せい パルスセンシング(Tunable resistive pulse sensing; TRPS)は、個々 ここ のウイルス粒子 りゅうし がサイズ調整 ちょうせい 可能 かのう なナノポアを通過 つうか するところを1つずつ測定 そくてい することにより、高 こう スループットの単一 たんいつ 粒子 りゅうし 測定 そくてい が可能 かのう な測定 そくてい 技術 ぎじゅつ である[ 16] 。溶液 ようえき 中 ちゅう のウイルス粒子 りゅうし のサイズと濃度 のうど を高 こう 解像度 かいぞうど で同時 どうじ に測定 そくてい できるという利点 りてん があり、サンプルの安定 あんてい 性 せい や凝集 ぎょうしゅう 体 たい 評価 ひょうか 、総 そう ウイルス粒子 りゅうし 濃度 のうど (vp/mL)測定 そくてい に使用 しよう できる[ 17] 。
TRPSの測定 そくてい はイオン性 せい 緩衝 かんしょう 液 えき 中 ちゅう で行 おこな われ、分析 ぶんせき 前 まえ にサンプルを前 ぜん 染色 せんしょく する必要 ひつよう がないため、この手法 しゅほう は蛍光 けいこう 色素 しきそ による前 ぜん 処理 しょり を必要 ひつよう とする手法 しゅほう よりも迅速 じんそく であり、総 そう 調製 ちょうせい 時間 じかん と測定 そくてい 時間 じかん はサンプルあたり10分 ふん 以下 いか である。TRPSによるウイルス分析 ぶんせき はqViro-Xシステムとして市販 しはん されており、測定 そくてい 後 ご にオートクレーブ処理 しょり による失 しつ 活 かつ が可能 かのう である。
ほとんどのフローサイトメーターはウイルス定量 ていりょう には十分 じゅうぶん な感度 かんど を持 も たないが、ウイルス定量 ていりょう 可能 かのう なフローサイトメーターはいくつか市販 しはん されている。ウイルスカウンターは、共 とも に局在 きょくざい するタンパク質 たんぱくしつ と核酸 かくさん を蛍光 けいこう により検出 けんしゅつ することで、サンプル中 ちゅう の完全 かんぜん ウイルス粒子 りゅうし 数 すう を定量 ていりょう する。サンプルは、タンパク質 たんぱくしつ に特異 とくい 的 てき な色素 しきそ と核酸 かくさん に特異 とくい 的 てき な色素 しきそ の2つの色素 しきそ で染色 せんしょく され、流 りゅう 路 ろ 中 ちゅう を流 なが れる粒子 りゅうし をレーザーで分析 ぶんせき する。ウイルス粒子 りゅうし の濃度 のうど (vp/mL)は、2つの異 こと なる蛍光 けいこう チャネルで同時 どうじ に計測 けいそく された粒子 りゅうし 数 すう と、測定 そくてい されたサンプルの流量 りゅうりょう から測定 そくてい される[ 18] 。結果 けっか は一般 いっぱん 的 てき にTEMと近 ちか い結果 けっか が得 え られる。この分析 ぶんせき 法 ほう では105 –109 VP/mLでの範囲 はんい で直線 ちょくせん 性 せい があり、分析 ぶんせき 時間 じかん は約 やく 10分 ふん でサンプル調製 ちょうせい 時間 じかん も短 みじか い。
定量 ていりょう ポリメラーゼ連鎖 れんさ 反応 はんのう (qPCR)[ 編集 へんしゅう ]
定量 ていりょう PCR(Quantitative polymerase chain reaction; qPCR)は、ポリメラーゼ連鎖 れんさ 反応 はんのう を利用 りよう してウイルスDNA またはRNA を増幅 ぞうふく し、蛍光 けいこう により検出 けんしゅつ と定量 ていりょう を行 おこな う分析 ぶんせき 法 ほう 。一般 いっぱん に、qPCRでは、未知 みち のサンプルと既知 きち の濃度 のうど の標準 ひょうじゅん の段階 だんかい 希釈 きしゃく を検量 けんりょう 線 せん として並行 へいこう して比較 ひかく 分析 ぶんせき することで定量 ていりょう する。定量 ていりょう 的 てき 検出 けんしゅつ は、配列 はいれつ 特異 とくい 的 てき プローブやSYBR Green などの非特異 ひとくい 的 てき 蛍光 けいこう 色素 しきそ など、さまざまな蛍光 けいこう 検出 けんしゅつ 法 ほう により行 おこな う[ 19] 。TaqMan(Applied Biosystemsが開発 かいはつ )、Molecular Beacons、またはScorpionなどの配列 はいれつ 特異 とくい 的 てき プローブは、反応 はんのう 中 ちゅう に生成 せいせい された適切 てきせつ な配列 はいれつ のDNAにのみ結合 けつごう し蛍光 けいこう を発 はっ する。 SYBR Green色素 しきそ は、反応 はんのう 中 ちゅう に生成 せいせい されたすべての二 に 本 ほん 鎖 くさり DNA[ 20] に結合 けつごう し蛍光 けいこう を発 はっ する。SYBR Greenは利用 りよう しやすいが、特異 とくい 性 せい がなく感度 かんど が低 ひく いため、配列 はいれつ 特異 とくい 的 てき プローブのqPCR検出 けんしゅつ 法 ほう が使用 しよう されることが多 おお い。内部 ないぶ 標準 ひょうじゅん を含 ふく む複数 ふくすう のサンプルからのCt値 ち (増幅 ぞうふく 産物 さんぶつ が統計 とうけい 的 てき に有意 ゆうい な増加 ぞうか を示 しめ したPCRサイクル数 すう )の比較 ひかく を通 つう じて相対 そうたい 定量 ていりょう を行 おこな う比較 ひかく しきい値 ち 法 ほう などqPCRには多 おお くのバリエーションがある。PCRは、完全 かんぜん な感染 かんせん 性 せい ウイルス粒子 りゅうし (ビリオン )、壊 こわ れたウイルス粒子 りゅうし 、溶液 ようえき 中 ちゅう の遊離 ゆうり 核酸 かくさん を含 ふく む、すべての標的 ひょうてき 核酸 かくさん を増幅 ぞうふく する。このため、qPCRの結果 けっか (ゲノムコピー/mLで表 あらわ される)は、TEMの結果 けっか よりも通常 つうじょう 大 おお きな値 ね になる。ウイルスの定量 ていりょう 化 か では、核酸 かくさん のコピー数 すう に対 たい するビリオンの比率 ひりつ が1対 たい 1になることは稀 まれ である。これは、ウイルス複製 ふくせい 中 ちゅう に、核酸 かくさん とウイルスタンパク質 たんぱくしつ が常 つね に1:1の比率 ひりつ で生成 せいせい されるとは限 かぎ らず、ウイルスの組 く み立 た てプロセスにより、完全 かんぜん なビリオン、空 そら のキャプシド や、過剰 かじょう な遊離 ゆうり ウイルスゲノムが生 しょう じることによる。口蹄疫 こうていえき ウイルスの例 れい では、活発 かっぱつ に複製 ふくせい している宿主 しゅくしゅ 細胞 さいぼう 内 ない の全 ぜん ビリオンとRNAコピーの比率 ひりつ は約 やく 1:1000である[ 21] 。qPCRベースのウイルス定量 ていりょう 用 よう の製品 せいひん は、多 おお くの企業 きぎょう から市販 しはん されている(例 れい :Invitrogen、Roche、Qiagenなど)。 qPCRによる定量 ていりょう の利点 りてん には、迅速 じんそく な分析 ぶんせき 時間 じかん (1〜4時 じ 間 あいだ )と感度 かんど (他 た の方法 ほうほう よりもはるかに低 ひく い濃度 のうど のウイルスを検出 けんしゅつ できる)などがある。
酵素 こうそ 免疫 めんえき 測定 そくてい 法 ほう (ELISA)[ 編集 へんしゅう ]
ELISA図 ず
ELISA は、酵素 こうそ に結合 けつごう した特定 とくてい の抗体 こうたい を利用 りよう して、サンプル中 ちゅう の未知 みち の量 りょう の抗原 こうげん (すなわちウイルス)の存在 そんざい を検出 けんしゅつ するタンパク質 たんぱくしつ 検出 けんしゅつ 法 ほう のより現代 げんだい 的 てき な手法 しゅほう である。サンプル中 ちゅう の抗原 こうげん の濃度 のうど に応 おう じて、酵素 こうそ が試薬 しやく を検出 けんしゅつ 可能 かのう な信号 しんごう に変換 へんかん することで、抗原 こうげん 抗体 こうたい 結合 けつごう 反応 はんのう を検出 けんしゅつ ・定量 ていりょう 化 か する[ 22] 。西洋 せいよう ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、シグナルを増幅 ぞうふく し、分析 ぶんせき 法 ほう の感度 かんど を高 たか めることができることから、ELISAでよく利用 りよう される酵素 こうそ である。 ELISA法 ほう には多 おお くの手法 しゅほう があるが、一般 いっぱん に直接 ちょくせつ 法 ほう 、間接 かんせつ 法 ほう 、競合 きょうごう 法 ほう 、サンドイッチ、逆 ぎゃく ELISA法 ほう のいずれかに分類 ぶんるい できる[ 23] 。ELISAキットは多 おお くの企業 きぎょう (例 れい :Invitrogen、Santa Cruz Biotechnology Inc.)から市販 しはん されており、定量 ていりょう 化 か は一般 いっぱん 的 てき に発色 はっしょく レポーターや蛍光 けいこう による。この手法 しゅほう は、従来 じゅうらい の方法 ほうほう よりもはるかに労力 ろうりょく がかからず、抗体 こうたい のインキュベーション時間 じかん に応 おう じ4〜24時 じ 間 あいだ ほどかかる。
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