ウイルス定量ていりょう

ウイルスの定量ていりょうは、ウイルス濃度のうどを測定そくていするために特定とくていの容量ようりょう内ないのウイルスの数かずを数かぞえること。産業さんぎょう・学術がくじゅつなどでの研究けんきゅう開発かいはつ（R&D）のみならず、製造せいぞうでもさまざまな工程こうていにおいてウイルスの量りょうが重要じゅうようになることから必要ひつようになる。たとえば、ウイルスワクチンや、ウイルスベクターを使用しようした組くみ換かえタンパク質たんぱくしつ、ウイルス抗原こうげんの生産せいさんでは、生産せいさん収量しゅうりょうを最適さいてき化かし、常つねに変化へんかする需要じゅようや用途ようとに対応たいおうするため、プロセスを継続けいぞく的てきに適応てきおう・監かん視しする目的もくてきでウイルス定量ていりょうを必要ひつようとする。既知きちのウイルスを定量ていりょう化かする必要ひつようがある例れいとして、クローンスクリーニング、感染かんせん多重たじゅう度ど（MOI）の最適さいてき化か、細胞さいぼう培養ばいよう法ほうの改良かいりょうなどがある。この項こうでは、液体えきたいサンプル中ちゅうのウイルスを定量ていりょう化かするために現在げんざい使用しようされているさまざまな手法しゅほうについて説明せつめいする。手法しゅほうは従来じゅうらいの手法しゅほうと最新さいしんの手法しゅほうの2つのカテゴリに分わけられる。従来じゅうらいの手法しゅほうは、何なん十じゅう年ねんにもわたって使用しようされてきた業界ぎょうかい標準ひょうじゅんの手法しゅほうであるが、一般いっぱん的てきに時間じかんがかかり、労力ろうりょくを必要ひつようとする。最新さいしんの手法しゅほうは、定量ていりょう化か時間じかんを大幅おおはばに短縮たんしゅくする比較的ひかくてき新あたらしい市販しはんの製品せいひんやキットである。ただし、すべての手法しゅほうの網羅もうら的てきなレビューではなく、従来じゅうらいの手法しゅほうと新あたらしい市販しはんの手法しゅほうの代表だいひょう例れいを示しめす。ウイルスの定量ていりょう化かには他ほかにも公開こうかいされた方法ほうほうが存在そんざいする可能かのう性せいがあるが、ここでは非ひ商用しょうようの手法しゅほうについては説明せつめいしない。

従来じゅうらい法ほう

プラークアッセイ

単純たんじゅんヘルペスウイルスのプラーク

プラークベースのアッセイは、感染かんせん量りょうからウイルス濃度のうどを測定そくていする標準ひょうじゅん的てきな方法ほうほうである。プラークアッセイは、ウイルス量りょうの1つの尺度しゃくどであるウイルスサンプル中ちゅうのプラーク形成けいせい単位たんい（pfu）の数かずを測定そくていする。この測定そくてい法ほうは、ペトリ皿さらまたはマルチウェルプレートで実施じっしされる微生物びせいぶつ学がく的てき手法しゅほうであり、具体ぐたい的てきには、コンフルエントな単たん層そうの宿主しゅくしゅ細胞さいぼうに、さまざまな希釈きしゃく率りつでウイルスを感染かんせんさせ、寒天かんてんやカルボキシメチルセルロースなどの半はん固体こたい培地ばいちで覆おおって、ウイルス感染かんせんが際限さいげんなく広ひろがるのを防ふせぐ。ウイルスプラークは、ウイルスが固定こてい細胞さいぼう単たん層そう内ないの細胞さいぼうに感染かんせんすると形成けいせいされる。ウイルスに感染かんせんした細胞さいぼうは溶解ようかいし、隣接りんせつする細胞さいぼうに感染かんせんを広ひろげ、感染かんせんから溶解ようかいまでのサイクルが繰くり返かえされる。感染かんせんした細胞さいぼう領域りょういきは、光学こうがく顕微鏡けんびきょうまたは視覚しかく的てきに見みることができるプラーク（感染かんせんしていない細胞さいぼうに囲かこまれた感染かんせん領域りょういき）を形成けいせいする。操作そうさの具体ぐたい例れいとしては、重層じゅうそうした培地ばいちを洗あらい流ながし、細胞さいぼう質しつが着色ちゃくしょくするまでクリスタルバイオレット溶液ようえきを添加てんかし15分間ふんかん静しずか置おけする。余分よぶんな染色せんしょく液えきを水みずで静しずかに取とり除のぞくと、死しんだ細胞さいぼうの位置いちが無む着色ちゃくしょくで示しめされる。プラークの形成けいせいには、分析ぶんせきするウイルスによって異ことなるが、3〜14日にちかかる場合ばあいがある。プラークは通常つうじょう手動しゅどうでカウントされ、その結果けっかは、プレートの調製ちょうせいに使用しようされた希釈きしゃく倍率ばいりつを乗じょうじてサンプル単位たんい体積たいせきあたりのプラーク形成けいせい単位たんいの数かず（pfu/mL）を計算けいさんする。 pfu/mLの結果けっかは、サンプル内ないの感染かんせん性せい粒子りゅうしの数かずを表あらわし、形成けいせいされた各かくプラークが1つの感染かんせん性せいウイルス粒子りゅうしを表あらわすという仮定かていに基もとづいた数かずである。

フォーカス形成けいせいアッセイ（FFA）

ロタウイルスに感染かんせんした細胞さいぼう（上うえ）と感染かんせんしていない細胞さいぼう（下した）

フォーカス形成けいせいアッセイ（FFA）はプラークアッセイの一部いちぶであるが、FFAはウイルス抗原こうげんに特異とくい的てきな蛍光けいこう標識ひょうしき抗体こうたいを使用しようして、感染かんせんした宿主しゅくしゅ細胞さいぼうとプラークが形成けいせいされる前まえの感染かんせんウイルス粒子りゅうしを検出けんしゅつする免疫めんえき染色せんしょく技術ぎじゅつを用もちいる。 FFAは、プラーク形成けいせいと異ことなり細胞さいぼう溶解ようかいを必要ひつようとしないことから、細胞さいぼう膜まくを溶解ようかいしないプラークアッセイに適てきさないウイルス種しゅの定量ていりょうに特とくに用もちいられる。プラークアッセイと同様どうように、単たん層そうの宿主しゅくしゅ細胞さいぼうに段階だんかい希釈きしゃくしたウイルスサンプルを感染かんせんさせ、感染かんせん性せいウイルスの拡散かくさんを制限せいげんする半はん固体こたい重層じゅうそう培地ばいちの下したで比較的ひかくてき短みじかい培養ばいよう時間じかん（24〜72時じ間あいだなど）インキュベートし、局所きょくしょ的てきな感染かんせん細胞さいぼうのクラスター（フォーカス、病巣びょうそう）を形成けいせいする。続つづいてプレートをウイルス抗原こうげんに対たいする蛍光けいこう標識ひょうしき抗体こうたいで染色せんしょくし、蛍光けいこう顕微鏡けんびきょうを使用しようしてフォーカスの数かずを数かぞえ、定量ていりょうする。 FFA法ほうでは、通常つうじょう、プラークや50％組織そしき培養ばいよう感染かんせん量りょう（TCID₅₀）アッセイよりも短時間たんじかんで結果けっかが得えられるが、必要ひつような試薬しやくや機器ききの点てんで高価こうかになることがある。測定そくてい時間じかんは、測定そくてい者しゃが数かぞえる領域りょういきのサイズにも依存いぞんする。より大おおきな領域りょういきはより多おおくの時間じかんを必要ひつようとするが、より正確せいかくな値ねとなる。 FFAの結果けっかは、ミリリットルあたりのフォーカス形成けいせい単位たんい（FFU/mL）として表あらわされる。

限界げんかい希釈きしゃく法ほう

50％組織そしき培養ばいよう感染かんせん量りょう（50% Tissue Culture Infective Dose: TCID₅₀）は、感染かんせん性せいのウイルス力ちから価かの尺度しゃくどである。TCID₅₀は接種せっしゅされた組織そしき培養ばいよう細胞さいぼうの50％を殺ころす、あるいは細胞さいぼう変性へんせい効果こうかを生うむのに必要ひつようなウイルスの量りょうを定量ていりょうする。TCID₅₀は臨床りんしょう研究けんきゅうなどにおいてウイルスの致死ちし量りょうを決定けっていする必要ひつようがある場合ばあいや、ウイルスがプラークを形成けいせいしない場合ばあいによく用もちいられる。組織そしき培養ばいようでの操作そうさ例れいとして、宿主しゅくしゅ細胞さいぼうを播種はしゅし、段階だんかい希釈きしゃくしたウイルスを添加てんか、培養ばいよう後ご、死滅しめつした細胞さいぼう（感染かんせん細胞さいぼう）の割合わりあいを手動しゅどうで観察かんさつする。各かくウイルス希釈きしゃくでの割合わりあいを記録きろくし、結果けっかから数学すうがく的てきにTCID₅₀を計算けいさんする。測定そくてい方法ほうほうや測定そくてい原理げんりの違ちがいから、TCID₅₀やPFU/ml、他たの感染かんせん性せいアッセイの結果けっかは等価とうかではない。この手法しゅほうは、細胞さいぼうの感染かんせんが必要ひつようであり、最大さいだい1週間しゅうかんかかる場合ばあいがある。

TCID₅₀計算けいさんには、一般いっぱん的てきに以下いかの2つの計算けいさん方法ほうほうが使用しようされる（EC₅₀、IC₅₀、LD₅₀などの他ほかのタイプの50％エンドポイントの計算けいさんにも使用しようされる）

• スピアマン・カーバー法ほう
• リード・ミュンヒ法ほう

数学すうがく的てきには、TCID₅₀で陰性いんせいだったウェルは0個このプラーク形成けいせい単位たんいを表あらわし、陽性ようせいだったウェルはそれぞれ1個いっこ以上いじょうのプラーク形成けいせい単位たんいを表あらわすので、予想よそうされるPFUはTCID₅₀の2分ぶんの1よりも若干じゃっかん大おおきくなる。ポアソン分布ぶんぷに基もとづくと、より正確せいかくな推定すいてい値ちが得えられ、約やく0.69 PFU = 1 TCID₅₀である。ポアソン分布ぶんぷは、一定いっていの空間くうかんにおいて、既知きちの平均へいきん発生はっせい確かく率りつで発生はっせいするランダムなイベントの発生はっせい回数かいすうを表あらわす確かく率りつ分布ぶんぷである。観測かんそくされた陰性いんせいのウェルは感染かんせんイベントが0回かい発生はっせいしたとみなされることから、P(0)は陰性いんせいのウェルの比率ひりつであり、mは体積たいせきあたりの感染かんせん単位たんいの平均へいきん数すう（PFU/ml）であることから、P(0) = e^-mである。TCID₅₀として表あらわされる力ちから価かの場合ばあい、P(0) = 0.5であるから、e^-m = 0.5、すなわちm = -ln 0.5であり、これは約やく0.69と計算けいさんされる。ただし、実際じっさいには、この関係かんけいは同おなじウイルスと細胞さいぼうの組くみ合あわせでも当あてはまらないことがある。これは、2種類しゅるいの測定そくてい法ほうの測定そくてい条件じょうけんが異ことなることや、ウイルスの感染かんせん力りょくは細胞さいぼう年齢ねんれい、重層じゅうそう培地ばいち等とうに非常ひじょうに影響えいきょうを受うけやすいことによる。しかし、次つぎの文献ぶんけんでは、この関係かんけいを異ことなる形かたちで定義ていぎしている。同おなじ細胞さいぼう系けいを使用しようし、ウイルスがそれらの細胞さいぼう上じょうでプラークを形成けいせいし、プラーク形成けいせいを阻害そがいするような処置しょちを加くわえないと仮定かていすると、1 mlのウイルスストックはTCID₅₀の約やく半分はんぶんの数かずのプラーク形成けいせい単位たんい（PFU）を持もつことが予想よそうされる。これは推定すいていに過すぎないが、添加てんかした細胞さいぼう層そうの50％に感染かんせんする限界げんかい希釈きしゃく液えきでは、感染かんせんした細胞さいぼう層そうに最初さいしょに1つのプラークができると予想よそうされることが多おおいという根拠こんきょに基もとづいている。場合ばあいによっては、偶然ぐうぜんにも2つ以上いじょうのプラークが形成けいせいされることもあるので、実際じっさいのPFU数すうは実験じっけん的てきに決定けっていされるべきである。(ATCC - Converting TCID50 to plaque forming units PFU-124を参照さんしょう)

タンパク質たんぱくしつ定量ていりょう

タンパク質たんぱくしつベースのウイルス定量ていりょう法ほうにはいくつかの種類しゅるいがある。一般いっぱんに、タンパク質たんぱくしつ定量ていりょうでは、感染かんせんした細胞さいぼうやウイルス粒子りゅうしの数かずではなく、サンプル中ちゅうの総そうタンパク質たんぱくしつ量りょうか、特定とくていのウイルスタンパク質たんぱくしつの量りょうのいずれかを定量ていりょうする。一般いっぱん的てきには蛍光けいこう検出けんしゅつによって定量ていりょうすることが最もっとも多おおい。サンプル中ちゅうのタンパク質たんぱくしつを直接ちょくせつ定量ていりょうする方法ほうほうもあるが、タンパク質たんぱくしつ定量ていりょうの前まえに宿主しゅくしゅ細胞さいぼうに感染かんせんさせ、培養ばいようしてウイルスの増殖ぞうしょくする場合ばあいもある。サンプル中ちゅうのタンパク質たんぱくしつ（すなわちウイルス）の量りょうと測定そくてい法ほう自体じたいの感度かんどに応おうじて使用しようする測定そくてい法ほうが選えらばれる。ウイルスの増幅ぞうふくが必要ひつような場合ばあい、分析ぶんせき前まえに細胞さいぼうやウイルスの溶解ようかい・分解ぶんかいが行おこなわれることが多おおい。ほとんどのタンパク質たんぱくしつベースの測定そくてい法ほうは比較的ひかくてき迅速じんそくで感度かんどが高たかいが、正確せいかくな定量ていりょうには標準ひょうじゅん品ひんを必要ひつようとし、実際じっさいのウイルス粒子りゅうし濃度のうどではなくタンパク質たんぱくしつを定量ていりょうしている。以下いかは、広ひろく使用しようされているタンパク質たんぱくしつベースの定量ていりょう法ほうの具体ぐたい例れいである。

血球けっきゅう凝集ぎょうしゅうアッセイ

詳細しょうさいは「赤血球せっけっきゅう凝集ぎょうしゅうアッセイ」を参照さんしょう

血球けっきゅう凝集ぎょうしゅうアッセイ（HA）は、インフルエンザウイルスの定量ていりょうに代表だいひょうされる一般いっぱん的てきな非ひ蛍光けいこうタンパク質たんぱくしつ定量ていりょう法ほうである。インフルエンザウイルスの表面ひょうめんタンパク質たんぱくしつである血球けっきゅう凝集ぎょうしゅう素もとが赤血球せっけっきゅうを凝集ぎょうしゅうさせる反応はんのうにより定量ていりょうしている。この定量ていりょう法ほうでは、インフルエンザサンプルの希釈きしゃく液えきを1％赤血球せっけっきゅう溶液ようえきと1時じ間あいだ培養ばいようし、凝集ぎょうしゅうが最初さいしょに発生はっせいするウイルス希釈きしゃく液えきを目視もくしで確認かくにんする。この定量ていりょう法ほうの結果けっかは赤血球せっけっきゅう凝集ぎょうしゅう単位たんい（hemagglutination units: HAU）の形かたちで得えられ、通常つうじょう、PFUに対たいする比率ひりつは10⁶の範囲はんいである 。この定量ていりょう法ほうは測定そくていに約やく1〜2時じ間あいだかかり、測定そくてい結果けっかは操作そうさ者しゃの技術ぎじゅつや経験けいけんによって大おおきく異ことなることがある。

血球けっきゅう凝集ぎょうしゅう阻害そがいアッセイ（HI）は、血清けっせい中ちゅうのインフルエンザ特異とくい的てき抗体こうたい濃度のうどの測定そくていによく用もちいられるHAアッセイのうちの一いち手法しゅほうである。血清けっせい中ちゅうにインフルエンザウイルスに対たいする抗体こうたいが十分じゅうぶんな濃度のうどで存在そんざいする場合ばあい、ウイルスの赤血球せっけっきゅうへの付着ふちゃくが妨害ぼうがいされ、血球けっきゅう凝集ぎょうしゅう反応はんのうが阻害そがいされることを利用りようした測定そくてい法ほうである。

ビシンコニン酸さんアッセイ

詳細しょうさいは「ビシンコニン酸さんアッセイ」を参照さんしょう

ビシンコニン酸さんアッセイ（BCA）は、単純たんじゅんな比ひ色しょく測定そくていによる最もっとも一般いっぱん的てきなタンパク質たんぱくしつ定量ていりょう分析ぶんせき法ほうである。 BCAはLowry法ほうやBradford法ほうに類似るいじしており、現在げんざいThermo Fisher Scientific社しゃとなっているPierce社しゃによって最初さいしょに市販しはん化かされた。 BCAアッセイでは、タンパク質たんぱくしつのペプチド結合けつごうがCu²⁺をCu¹⁺に定量ていりょう的てきに還元かんげんし、薄うすい青色あおいろを呈ていする。BCAはCu¹⁺を2:1の比率ひりつでキレートし、562 nmに吸収きゅうしゅうを持もつより濃こい色いろの錯体さくたいを形成けいせいする。分光ぶんこう光度こうど計けいまたはプレートリーダーで562 nmでの試料しりょうの吸光度どを測定そくていし、既知きちの標準ひょうじゅん曲線きょくせんと比較ひかくすることで、試料しりょう中ちゅうの総そうタンパク質たんぱくしつ濃度のうどを測定そくていすることができる。分析ぶんせきの所要しょよう時間じかんは30分ふん〜1時じ間あいだほどである。この分析ぶんせき法ほうは汎用はんよう的てきで高速こうそくだが、すべてのタンパク質たんぱくしつを定量ていりょうするため特異とくい性せいに欠かけ、定量ていりょうするウイルス試料しりょう中ちゅうの宿主しゅくしゅ細胞さいぼう由来ゆらいタンパク質たんぱくしつの混入こんにゅうが非常ひじょうに低てい濃度のうどである必要ひつようがある。

一元いちげん放射状ほうしゃじょう免疫めんえき拡散かくさん法ほう

一元いちげん放射状ほうしゃじょう免疫めんえき拡散かくさん法ほう（single radial immunodiffusion method；SRID法ほう）は、マンチーニ法ほうとも呼よばれ、半はん固形こけい培地ばいち（寒天かんてんなど）上じょうでの拡散かくさんによって特定とくていのウイルス抗原こうげんの量りょうを検出けんしゅつするタンパク質たんぱくしつ定量ていりょう分析ぶんせきである。目的もくてきの抗原こうげんに特異とくい的てきな抗こう血清けっせいを含ふくむ培地ばいちの上うえに、抗原こうげんを含ふくむ円筒えんとう状じょうのディスクを中央ちゅうおうに置おく。抗原こうげんは培地ばいちに放射状ほうしゃじょうに拡散かくさんし、平衡へいこうに達たっするまで成長せいちょうする免疫めんえき沈降ちんこうのリングが形成けいせいされる。測定そくてい時間じかんは、抗原こうげんと抗体こうたいの平衡へいこう時間じかんに応おうじて、10時じ間あいだから数日すうじつの範囲はんいである。リングの直径ちょっけいは、タンパク質たんぱくしつ濃度のうどの対数たいすうと直線ちょくせん関係かんけいにあり、定量ていりょうには既知きちのタンパク質たんぱくしつ標準ひょうじゅんの直径ちょっけいと比較ひかくする。いくつかのキットと血清けっせいがこの分析ぶんせき用ように市販しはんされている（例れい：バインディングサイト株式会社かぶしきがいしゃ）。

透過とうか型がた電子でんし顕微鏡けんびきょう

ポリオウイルスのネガティブ染色せんしょくTEM（バー: 50 nm）

新型しんがたH1N1ビリオンの組織そしき包つつみ埋うめ切片せっぺん

透過とうか型がた電子でんし顕微鏡けんびきょう(Transmission Electron Microscope; TEM)は、磁場じばで集束しゅうそくした電子でんし線せんをサンプルにあて画像がぞう化かする電子でんし顕微鏡けんびきょうの一種いっしゅであり、光学こうがく顕微鏡けんびきょうの1000倍ばい（0.2 nm）の空間くうかん分解能ぶんかいのうを持もつ。極きょく薄うすくしたネガティブ染色せんしょくのサンプルが必要ひつようであり、サンプルの準備じゅんびとして、コーティングしたTEMグリッドと呼よばれる金属きんぞく板ばんの上うえへの標本ひょうほんを載のせ、電子でんし不ふ透過とうか性せいの液体えきたいによりネガティブ染色せんしょくを行おこなう。 組織そしきに埋没まいぼつしているサンプルは、薄うすく切片せっぺん化かすれば検査けんさ可能かのうである。サンプルの準備じゅんびはプロトコルと実験じっけん者しゃによって異ことなるが、通常つうじょう、数時間すうじかんかかる。 TEM画像がぞうは個々ここのウイルス粒子りゅうしを観察かんさつでき、定量ていりょう的てき画像がぞう分析ぶんせきによりウイルス濃度のうどの測定そくていも可能かのうである。TEMによる高こう解像度かいぞうど画像がぞうは、他たの方法ほうほうでは難むずかしい粒子りゅうしの形態けいたい情報じょうほうを得えることができる。感染かんせん力りょくの有無うむに関係かんけいなく、すべての粒子りゅうしの数かずを1 mLあたりのウイルス様さま粒子りゅうし数かず（vlp/mL）として定量ていりょうするため、定量ていりょう的てきTEMの結果けっかは他たの分析ぶんせき結果けっかよりも大おおきくなることが多おおい。定量ていりょう的てきTEMは一般いっぱんに10⁶粒子りゅうし/mLを超こえるウイルス濃度のうどに適用てきようできる。機器ききのコストが高たかく、必要ひつようなスペースとサポート施設しせつが必要ひつようなため、TEMが利用りようできる施設しせつは限かぎられている。

最新さいしんの分析ぶんせき法ほう

調整ちょうせい可能かのう抵抗ていこうパルスセンシング（TRPS）

詳細しょうさいは「調整ちょうせい可能かのう抵抗ていこうパルスセンシング」を参照さんしょう

調整ちょうせい可能かのう抵抗ていこう性せいパルスセンシング（Tunable resistive pulse sensing; TRPS）は、個々ここのウイルス粒子りゅうしがサイズ調整ちょうせい可能かのうなナノポアを通過つうかするところを1つずつ測定そくていすることにより、高こうスループットの単一たんいつ粒子りゅうし測定そくていが可能かのうな測定そくてい技術ぎじゅつである。溶液ようえき中ちゅうのウイルス粒子りゅうしのサイズと濃度のうどを高こう解像度かいぞうどで同時どうじに測定そくていできるという利点りてんがあり、サンプルの安定あんてい性せいや凝集ぎょうしゅう体たい評価ひょうか、総そうウイルス粒子りゅうし濃度のうど（vp/mL）測定そくていに使用しようできる。

TRPSの測定そくていはイオン性せい緩衝かんしょう液えき中ちゅうで行おこなわれ、分析ぶんせき前まえにサンプルを前ぜん染色せんしょくする必要ひつようがないため、この手法しゅほうは蛍光けいこう色素しきそによる前ぜん処理しょりを必要ひつようとする手法しゅほうよりも迅速じんそくであり、総そう調製ちょうせい時間じかんと測定そくてい時間じかんはサンプルあたり10分ふん以下いかである。TRPSによるウイルス分析ぶんせきはqViro-Xシステムとして市販しはんされており、測定そくてい後ごにオートクレーブ処理しょりによる失しつ活かつが可能かのうである。

フローサイトメトリー

ほとんどのフローサイトメーターはウイルス定量ていりょうには十分じゅうぶんな感度かんどを持もたないが、ウイルス定量ていりょう可能かのうなフローサイトメーターはいくつか市販しはんされている。ウイルスカウンターは、共ともに局在きょくざいするタンパク質たんぱくしつと核酸かくさんを蛍光けいこうにより検出けんしゅつすることで、サンプル中ちゅうの完全かんぜんウイルス粒子りゅうし数すうを定量ていりょうする。サンプルは、タンパク質たんぱくしつに特異とくい的てきな色素しきそと核酸かくさんに特異とくい的てきな色素しきその2つの色素しきそで染色せんしょくされ、流りゅう路ろ中ちゅうを流ながれる粒子りゅうしをレーザーで分析ぶんせきする。ウイルス粒子りゅうしの濃度のうど（vp/mL）は、2つの異ことなる蛍光けいこうチャネルで同時どうじに計測けいそくされた粒子りゅうし数すうと、測定そくていされたサンプルの流量りゅうりょうから測定そくていされる。結果けっかは一般いっぱん的てきにTEMと近ちかい結果けっかが得えられる。この分析ぶんせき法ほうでは10⁵–10⁹ VP/mLでの範囲はんいで直線ちょくせん性せいがあり、分析ぶんせき時間じかんは約やく10分ふんでサンプル調製ちょうせい時間じかんも短みじかい。

定量ていりょうポリメラーゼ連鎖れんさ反応はんのう（qPCR）

詳細しょうさいは「定量ていりょうPCR」を参照さんしょう

定量ていりょうPCR（Quantitative polymerase chain reaction; qPCR）は、ポリメラーゼ連鎖れんさ反応はんのうを利用りようしてウイルスDNAまたはRNAを増幅ぞうふくし、蛍光けいこうにより検出けんしゅつと定量ていりょうを行おこなう分析ぶんせき法ほう。一般いっぱんに、qPCRでは、未知みちのサンプルと既知きちの濃度のうどの標準ひょうじゅんの段階だんかい希釈きしゃくを検量けんりょう線せんとして並行へいこうして比較ひかく分析ぶんせきすることで定量ていりょうする。定量ていりょう的てき検出けんしゅつは、配列はいれつ特異とくい的てきプローブやSYBR Greenなどの非特異ひとくい的てき蛍光けいこう色素しきそなど、さまざまな蛍光けいこう検出けんしゅつ法ほうにより行おこなう 。TaqMan（Applied Biosystemsが開発かいはつ）、Molecular Beacons、またはScorpionなどの配列はいれつ特異とくい的てきプローブは、反応はんのう中ちゅうに生成せいせいされた適切てきせつな配列はいれつのDNAにのみ結合けつごうし蛍光けいこうを発はっする。 SYBR Green色素しきそは、反応はんのう中ちゅうに生成せいせいされたすべての二に本ほん鎖くさりDNAに結合けつごうし蛍光けいこうを発はっする。SYBR Greenは利用りようしやすいが、特異とくい性せいがなく感度かんどが低ひくいため、配列はいれつ特異とくい的てきプローブのqPCR検出けんしゅつ法ほうが使用しようされることが多おおい。内部ないぶ標準ひょうじゅんを含ふくむ複数ふくすうのサンプルからのCt値ち（増幅ぞうふく産物さんぶつが統計とうけい的てきに有意ゆういな増加ぞうかを示しめしたPCRサイクル数すう）の比較ひかくを通つうじて相対そうたい定量ていりょうを行おこなう比較ひかくしきい値ち法ほうなどqPCRには多おおくのバリエーションがある。PCRは、完全かんぜんな感染かんせん性せいウイルス粒子りゅうし（ビリオン）、壊こわれたウイルス粒子りゅうし、溶液ようえき中ちゅうの遊離ゆうり核酸かくさんを含ふくむ、すべての標的ひょうてき核酸かくさんを増幅ぞうふくする。このため、qPCRの結果けっか（ゲノムコピー/mLで表あらわされる）は、TEMの結果けっかよりも通常つうじょう大おおきな値ねになる。ウイルスの定量ていりょう化かでは、核酸かくさんのコピー数すうに対たいするビリオンの比率ひりつが1対たい1になることは稀まれである。これは、ウイルス複製ふくせい中ちゅうに、核酸かくさんとウイルスタンパク質たんぱくしつが常つねに1:1の比率ひりつで生成せいせいされるとは限かぎらず、ウイルスの組くみ立たてプロセスにより、完全かんぜんなビリオン、空そらのキャプシドや、過剰かじょうな遊離ゆうりウイルスゲノムが生しょうじることによる。口蹄疫こうていえきウイルスの例れいでは、活発かっぱつに複製ふくせいしている宿主しゅくしゅ細胞さいぼう内ないの全ぜんビリオンとRNAコピーの比率ひりつは約やく1:1000である。qPCRベースのウイルス定量ていりょう用ようの製品せいひんは、多おおくの企業きぎょうから市販しはんされている（例れい：Invitrogen、Roche、Qiagenなど）。 qPCRによる定量ていりょうの利点りてんには、迅速じんそくな分析ぶんせき時間じかん（1〜4時じ間あいだ）と感度かんど（他たの方法ほうほうよりもはるかに低ひくい濃度のうどのウイルスを検出けんしゅつできる）などがある。

酵素こうそ免疫めんえき測定そくてい法ほう（ELISA）

ELISA図ず

ELISAは、酵素こうそに結合けつごうした特定とくていの抗体こうたいを利用りようして、サンプル中ちゅうの未知みちの量りょうの抗原こうげん（すなわちウイルス）の存在そんざいを検出けんしゅつするタンパク質たんぱくしつ検出けんしゅつ法ほうのより現代げんだい的てきな手法しゅほうである。サンプル中ちゅうの抗原こうげんの濃度のうどに応おうじて、酵素こうそが試薬しやくを検出けんしゅつ可能かのうな信号しんごうに変換へんかんすることで、抗原こうげん抗体こうたい結合けつごう反応はんのうを検出けんしゅつ・定量ていりょう化かする。西洋せいようワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、シグナルを増幅ぞうふくし、分析ぶんせき法ほうの感度かんどを高たかめることができることから、ELISAでよく利用りようされる酵素こうそである。 ELISA法ほうには多おおくの手法しゅほうがあるが、一般いっぱんに直接ちょくせつ法ほう、間接かんせつ法ほう、競合きょうごう法ほう、サンドイッチ、逆ぎゃくELISA法ほうのいずれかに分類ぶんるいできる。ELISAキットは多おおくの企業きぎょう（例れい：Invitrogen、Santa Cruz Biotechnology Inc.）から市販しはんされており、定量ていりょう化かは一般いっぱん的てきに発色はっしょくレポーターや蛍光けいこうによる。この手法しゅほうは、従来じゅうらいの方法ほうほうよりもはるかに労力ろうりょくがかからず、抗体こうたいのインキュベーション時間じかんに応おうじ4〜24時じ間あいだほどかかる。